楊靜雯　林麗婷　李天然

摘要：目的 觀察針刺對血管性癡呆大鼠前額葉皮層Toll樣受體4（TLR4）表達及下游炎癥因子白細胞介素（IL）-1β和IL-6表達的影響，探討針刺的腦保護作用。方法 50只大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、針刺組和非穴組。采用雙側(cè)頸總動脈永久性結(jié)扎方法制作血管性癡呆大鼠模型。造模后第3日針刺干預(yù)，每日1次，共2周。采用Morris水迷宮實驗評價大鼠空間學習記憶能力，免疫組化檢測小膠質(zhì)細胞標志物離子鈣結(jié)合蛋白1（Iba1）及TLR4表達，RT-PCR檢測炎癥因子IL-1β和IL-6的mRNA表達。結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠空間學習記憶能力降低，前額葉皮層Iba1、TLR4及IL-1β、IL-6表達升高；與模型組比較，針刺組大鼠空間學習記憶能力改善，前額葉皮層Iba1、TLR4及IL-1β、IL-6表達降低；非穴組無明顯改善。結(jié)論 針刺可抑制血管性癡呆大鼠前額葉皮質(zhì)小膠質(zhì)細胞激活，降低TLR4及其下游炎癥因子表達水平，改善大鼠空間學習記憶能力。

關(guān)鍵詞：血管性癡呆；針刺；小膠質(zhì)細胞；Toll樣受體4；炎癥反應(yīng)；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.06.012

中圖分類號：R245 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）06-0048-05

Effects of Acupuncture on Inflammation in Prefrontal Cortex of Vascular Dementia Rats

YANG Jing-wen1， LIN Li-ting1， LI Tian-ran1， ZHANG Shuai1， WANG Xue-rui1， LIU Cun-zhi2

1. Beijing Hospital of TCM Affiliated to Capital Medical University， Beijing 100010， China；

2. Dongfang Hospital， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100078， China

Abstract： Objective To observe the effects of acupuncture on TLR4， inflammation factors IL-1β and IL-6 expressions in the prefrontal cortex of vascular dementia （VD） rats； To investigate the brain protective mechanisms of acupuncture. Methods A total of 50 rats were randomly divided into sham-operation group， model group， acupuncture group， and placebo-acupuncture group. The animal model of VD was replicated by permanent bilateral common carotid artery occlusion （2VO） in rats. Acupuncture was performed at three days after surgery， once daily for two weeks. Morris water maze was used to test the cognitive function. The expressions of Iba1 and TLR4 were assessed by immunohistochemical method. Inflammation factors IL-1β and IL-6 mRNA expressions were tested by RT-PCR. Results Compared with sham-operation group， the model group rats showed impaired spatial learning and memory ability， and expression of Iba1， TLR4， and IL-1β， IL-6 increased. Compared with the model group， the spatial learning and memory abilities of the acupuncture group were improved， and the expression of Iba1， TLR4 and IL-1β， IL-6 in the prefrontal cortex decreased. These effects were not found in the placebo-acupuncture group. Conclusion The effect of acupuncture may be achieved by inhibiting microglia activate， decreasing the expressions of TLR4， IL-1β and IL-6 in the prefrontal cortex， resulting in improving spatial learning and memory ability of VD rats.

Keywords： vascular dementia； acupuncture； microgila； TLR4； inflammation； rats

血管性癡呆（vascular dementia，VD）是指各種腦血管疾病引起的大腦功能障礙而產(chǎn)生的一種慢性進行性獲得性認知功能損害綜合征。研究表明，炎癥反應(yīng)在慢性腦缺血后繼發(fā)性神經(jīng)損傷中起重要作用[1-2]。小膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中炎癥發(fā)生的主要細胞，在免疫應(yīng)答過程中起關(guān)鍵作用。Toll樣受體（TLRs）是一組典型的內(nèi)源性免疫反應(yīng)的識別受體，國外研究顯示，TLRs家族參與了神經(jīng)炎癥及癡呆的進程，Toll樣受體4（TLR4）介導了腦缺血炎性損傷[3]。近年來研究表明，針刺對VD有神經(jīng)保護作用[4-7]。有報道，針刺可通過抑制腦缺血后的炎癥反應(yīng)，調(diào)控炎性介質(zhì)釋放，發(fā)揮神經(jīng)保護作用[8]。本實驗觀察針刺對VD大鼠前額葉皮層TLR4表達及下游炎癥因子白細胞介素（IL）-1β和IL-6水平的影響，探討針刺的腦保護作用。

1 實驗材料

1.1 動物

10周齡SPF級健康雄性Wistar大鼠50只，體質(zhì)量300～320 g，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物許可證號SCXK（京）2016-0006。飼養(yǎng)于恒溫（25±1）℃、相對濕度40%～60%環(huán)境，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d。整個實驗過程符合動物倫理學標準。

1.2 主要試劑與儀器

PageRuler（美國Haoranbio公司），封閉用山羊血清（北京康為世紀公司），兔抗鼠Iba1一抗（美國Millipore公司），兔抗鼠TLR4一抗（美國Millipore公司），二步法抗兔/鼠通用型二抗試劑盒（上?；蚩萍加邢薰荆珼AB顯色劑（北京中杉金橋公司），炎癥因子及β-actin mRNA引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。Morris水迷宮（美國CSI公司），離心機（美國Beckma公司），電子天平（美國sart & rius公司），冰凍切片機（德國Leica公司），BX51型光學顯微鏡（日本Olympus公司），RG-3000熒光定量PCR儀（澳大利亞Corbett Research公司），華佗牌0.30 mm×25 mm一次性針灸針（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）。

2 實驗方法

2.1 造模

采用雙血管阻斷方法復(fù)制VD模型[9]。2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，麻醉后切開頸部正中皮膚，剝離肌肉，充分暴露雙側(cè)頸總動脈，將血管與迷走神經(jīng)用器械仔細分離，5-0絲線將雙側(cè)頸總動脈雙重絲線永久性結(jié)扎。假手術(shù)組除不結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈外其他操作同手術(shù)組。造模后大鼠死亡10只，將造模成功大鼠隨機分為模型組、針刺組和非穴組，每組10只。

2.2 干預(yù)

造模后第3日開始針刺治療。取穴參照動物穴位圖譜[10]。取“百會”、雙側(cè)“足三里”，行捻轉(zhuǎn)補法（捻轉(zhuǎn)角度<90°，頻率>120次/min，持續(xù)30 s）。非穴組選取雙側(cè)肋下髂嵴上10 mm作為對照刺激點，行平補平瀉法（捻轉(zhuǎn)角度90～180°，每分鐘60～120次，持續(xù)45 s）。每日1次，治療6 d，休息1 d，共治療12次。假手術(shù)組和模型組分別行與針刺組和非穴組相同時間、相同程度的捉抓刺激。

2.3 Morris水迷宮實驗

水迷宮直徑160 cm，高 40 cm，水深30 cm，水溫（23±1）℃，池壁上4個等距離點分水池為4個象限，任選一象限在其中央放置平臺。平臺無色透明，直徑10 cm，平臺沒于水面下2 cm，水池周圍放置的參照物保持不變。測試5 d，每日4次。實驗時，操作者將大鼠隨機從4個不同象限放入水中，記錄大鼠游泳速度和逃避潛伏期。若60 s大鼠仍未找到平臺，則將大鼠放置在平臺上停留10 s，逃避潛伏期記錄為60 s。實驗第6日撤除平臺，觀察60 s內(nèi)大鼠在池中平臺所在象限的時間。

2.4 取材及處理

末次針刺后第2日，大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉，大鼠麻醉后斷頭快速取出腦組織，分離前額葉皮層，-80 ℃冰箱保存。

2.5 RT-PCR檢測白細胞介素-1β、白細胞介素-6 mRNA表達

大鼠前額葉皮層組織用Trizol提取總RNA，用無RNA酶的DNA酶消化DNA雜質(zhì)，紫外分光光度計測RNA OD260/280比值，檢測RNA純度。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)條件：25 ℃ 5 min，50 ℃ 60 min，70 ℃ 15 min終止反應(yīng)。擴增反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min 后，變性（95 ℃ 10 s）、退火（60 ℃ 30 s）、延伸（70 ℃ 30 s）共40個循環(huán)，從70 ℃→95 ℃ 范圍內(nèi)收集熒光信號，共10 min，得到融解曲線。以β-actin基因表達量作為RT-PCR產(chǎn)物的內(nèi)參照，以Rotor-Gene6.0軟件收集循環(huán)閾值（Ct值，即每個反應(yīng)管內(nèi)熒光信號達到設(shè)定的閾值所需要循環(huán)數(shù)），目的基因相對mRNA表達用以下公式進行計算：目的基因相對mRNA表達=2-ΔΔCt，ΔCt=待測基因Ct值-管家基因Ct值。引物序列見表1。

2.6 免疫組化檢測離子鈣結(jié)合蛋白1、Toll樣受體4表達

室溫0.3%TritonX-100通透20 min，3%H2O2孵育20 min，滴加山羊血清封閉液，37 ℃孵育30 min，滴加一抗（1∶50），4 ℃過夜，滴加二抗，37 ℃孵育120 min。上述步驟間除羊血清外均用PBS洗3次，每次5 min。使用DAB顯色試劑盒室溫顯色，洗滌后蘇木素溶液復(fù)染，脫水封片。

3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以—x±s表示，組間比較采用方差分析，組間多重比較方差齊用LSD法，方差不齊用Dunnett's T3。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

4 結(jié)果

4.1 針刺對模型大鼠學習記憶能力的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠逃避潛伏期顯著延長，平臺所在象限時間顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05，P<0.01）；與模型組比較，針刺組大鼠逃避潛伏期顯著縮短，平臺所在象限時間顯著延長，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），非穴組未見明顯差異；針刺組大鼠逃避潛伏期較非穴組顯著縮短，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），針刺組大鼠平臺所在象限時間較非穴組顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結(jié)果見圖1、圖2。

4.2 針刺對模型大鼠前額葉皮層小膠質(zhì)細胞的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠前額葉皮層小膠質(zhì)細胞標記物離子鈣結(jié)合蛋白1（Iba1）陽性細胞數(shù)顯著增多（P<0.001）；與模型組比較，針刺組大鼠前額葉皮層Iba1陽性細胞數(shù)顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；與非穴組比較，針刺組鼠前額葉皮層Iba1陽性細胞數(shù)顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結(jié)果見圖3。

4.3 針刺對模型大鼠前額葉皮層Toll樣受體4表達的影響

TLR4免疫組化染色陽性表達產(chǎn)物呈棕黃色。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠前額葉皮層TLR4著色較深，陽性細胞數(shù)顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，針刺組大鼠前額葉皮層TLR4陽性細胞數(shù)顯著降低（P<0.01）；與非穴組比較，針刺組大鼠前額葉皮層TLR4表達顯著降低（P<0.01）。結(jié)果見圖4。

4.4 針刺對模型大鼠前額葉皮層炎癥因子表達的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠前額葉皮層炎癥因子IL-1β和IL-6 mRNA表達顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；與模型組比較，針刺組大鼠前額葉皮層IL-1β和IL-6 mRNA表達顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與非穴組比較，針刺組大鼠前額葉皮層炎癥因子IL-1β和IL-6 mRNA表達顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結(jié)果見圖5、圖6。

5 討論

目前，VD早期治療具有可逆性[11]。因此，研究其發(fā)病機制，尋找行之有效的治療方法是亟待解決的問題。腦血管病的病灶波及前額葉皮層，導致腦內(nèi)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，繼而引起神經(jīng)元損傷，使學習、記憶功能減退可能是VD的發(fā)病機制。本研究發(fā)現(xiàn)，針刺能抑制小膠質(zhì)細胞激活，減少TLR4表達，降低大腦前額葉皮層炎癥水平，改善神經(jīng)元損傷，從而提高VD大鼠學習記憶能力。

VD屬中醫(yī)學“呆癥”范疇，病位在腦，基本病機是肝腎精血不足，髓?？仗摚叼霰宰?，神機失用。結(jié)合經(jīng)絡(luò)理論，《難經(jīng)·二十八難》云：“督脈者……上至風府，入屬于腦?！惫梳槾贪贂商岫叫涯X。足三里屬足陽明胃經(jīng)，脾胃為氣血生化之源，能夠運化營養(yǎng)物質(zhì)營養(yǎng)全身及腦，有助于記憶的改善。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，“足三里”“百會”作為VD動物研究中最常用的穴位，對改善VD大鼠學習記憶能力效果最顯著[5，12]。

海馬是與人類的學習記憶等高級功能有密切關(guān)系的重要功能區(qū)，對缺血低灌注損傷有易感性，被認為是與VD大鼠認知損害相關(guān)的主要腦區(qū)，但與認知功能密切相關(guān)的前額葉皮層在神經(jīng)退行性疾病的病理過程中也有著潛在作用[13]。有研究顯示，針刺能改善大鼠海馬炎癥反應(yīng)，發(fā)揮神經(jīng)保護作用[14]，但是針刺對前額葉皮層的相關(guān)研究較少。

腦缺血后小膠質(zhì)細胞介導的炎癥反應(yīng)參與了VD的發(fā)生與發(fā)展。TLR4主要表達于小膠質(zhì)細胞，可被多種內(nèi)源性或外源性因子所激活，通過進一步激活下游的信號通路，參與小膠質(zhì)細胞介導的神經(jīng)炎癥反應(yīng)[15]。目前的研究發(fā)現(xiàn)，TLR4依賴的小膠質(zhì)細胞激活參與了多種神經(jīng)免疫疾病及退行性疾病的慢性炎癥過程[16-17]。此外，近年研究發(fā)現(xiàn)，TLR4所介導的炎癥反應(yīng)還參與了腦缺血性疾病的發(fā)生。Gao Y等[3]研究表明，TLR4可誘導中樞神經(jīng)損傷，介導腦缺血炎性損傷。李瑩等[18]研究發(fā)現(xiàn)，TLR4 mRNA表達增加可能刺激腫瘤壞死因子-α（TNF-α）產(chǎn)生、分泌增多，從而參與介導腦梗死炎性損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，針刺可通過抑制TLR4表達，緩解慢性腦低灌注導致的炎癥反應(yīng)。

TLR4激活下游信號通路，導致一系列炎癥因子表達升高，促使白細胞趨化至損傷部位，引起神經(jīng)元損傷，使動物的學習、記憶功能減退。Campbell I L等[19]研究發(fā)現(xiàn)，腦內(nèi)高水平的IL-6可導致轉(zhuǎn)基因小鼠神經(jīng)元退化并影響學習和記憶。陳秋欣等[20]研究發(fā)現(xiàn)，針刺可降低血清及血腫組織中TNF-α、IL-6的含量，減輕腦出血后繼發(fā)性損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，針刺可降低VD大鼠大腦皮層炎癥因子IL-1β、IL-6的mRNA表達，從而改善大鼠學習記憶能力。

綜上，本研究以雙血管阻斷法建立的VD大鼠模型為研究對象，初步探討了針刺改善VD認知損害的炎癥機制。本研究結(jié)果從行為學觀察、炎癥調(diào)節(jié)因子TLR4表達及下游炎癥因子IL-1β、IL-6的mRNA表達3個方面，共同說明針刺“足三里”“百會”可抑制大腦前額葉皮層TLR4表達，降低炎癥因子IL-1β、IL-6的含量，從而改善VD大鼠的學習記憶能力，從機制上闡明針刺改善VD認知損害的可能靶點，為探討針刺治療VD提供了一定的依據(jù)。

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（收稿日期：2017-11-22）

（修回日期：2017-12-24；編輯：華強）