蔡英桂，尹麗陽，王宏波，陳 宇，曾 蓉，吳秀山，葉湘漓*

(1.湖南師范大學醫(yī)學院，湖南 長沙 410013； 2.湖南師范大學生命科學學院心臟發(fā)育研究中心，湖南 長沙 410081；3.中南大學湘雅二醫(yī)院，湖南 長沙 410011)

ASB家族(ankyrin repeat and SOCS box containing protein family，含錨蛋白重復序列-細胞因子信號抑制物盒蛋白家族)因在其氨基端和羧基端分別含有多個串聯重復的ankyrin repeat結構域和一個SOCS(suppressor of cytokine signaling)box結構域而得名。ASB的ankyrin repeat結構域最先是在酵母的細胞周期基因Swi/Cdc10和果蠅的Notch基因中發(fā)現的，可以與特異性的靶蛋白結合，介導蛋白與蛋白之間的相互作用；該結構域在蛋白中的重復次數最高可達33次，不過多數為6個以下[1,2]。目前已經發(fā)現的ASB家族成員共有18個，分別命名為ASB1-ASB18；其中ASB5、ASB9、ASB11、ASB13 和ASB15蛋白的主要序列相似，且都含有6個重復的ankyrin repeat結構域，該特征與ASB家族的其它成員存在明顯區(qū)別。不同ASB蛋白在其ankyrin repeat結構域的構象以及重復次數等方面的差異性提示其可能通過與不同的靶蛋白相結合而參與不同的生理過程[3-5]。

斑馬魚的Asb11與人類的ASB11高度同源。已有的研究表明，斑馬魚的Asb11基因位于第9號染色體上，含7個外顯子，cDNA全長為882 bp，編碼293個氨基酸，分子量約為32 kD；人類的ASB11基因位于Xp22.31上，由7個外顯子構成，亞細胞定位顯示ASB11蛋白在細胞質和細胞核中均有表達。斑馬魚的Asb11是體內經典Notch信號傳導的正調節(jié)因子，參與泛素化過程，影響胚胎神經祖細胞的發(fā)育，該過程依賴于Asb11蛋白的SOCS box[6,7]。SOCS box是ECS型E3泛素連接酶復合物的底物識別模塊，SOCS box域分為BC框和Cul框基序，Asb11的Cul5框是正確表達Notch靶基因的前提，缺乏Cul5框的斑馬魚突變體在Notch信號傳導方面存在明顯缺陷[8]。此外，Asb11是胚胎和成體再生性肌發(fā)生的主要調節(jié)者，也是腫瘤發(fā)生的候選基因之一[9-11]。ASB11可能參與了心臟和肌肉組織的發(fā)育過程，有關ASB11的研究對于揭示心臟發(fā)育中的相關信號通路和分子調控機理具有重要的意義。

DNA免疫是將包含目標蛋白DNA或者cDNA的重組真核表達載體直接注射到動物的肌肉、皮下或者腹腔等部位，利用宿主的轉錄系統(tǒng)合成外源目標蛋白抗原，并激活宿主的免疫系統(tǒng)，誘導免疫應答的發(fā)生[12-14]。DNA免疫的應答強弱與其表達載體表達抗原的能力以及免疫接種的途徑有關，其中,表達載體的表達能力主要取決于載體上的啟動子和增強子的強弱，而不同的免疫途徑產生免疫應答的機制和效果也不同。肌肉注射是最常見的DNA導入方式，具有操作簡便、免疫接種容量大、引起免疫反應持續(xù)時間長等特點[15,16]。真核表達質粒pCAGGS-P7是DNA免疫研究中最常用的質粒載體之一，含有雞的β-actin真核啟動子和CMV增強子，可使下游插入基因能在哺乳動物中高效表達，從而增強免疫效果[17,18]；而多個酶切位點利于目標片段的插入，Poly A可保證目標mRNA在體內的穩(wěn)定性。

本研究將帶有斑馬魚ASB11 cDNA的pCAGGS-P7/ASB11重組表達質粒通過肌肉注射到小鼠中，使其在小鼠體內引起免疫應答，經過多次免疫后，提取相應的血清進行Western Blot和免疫熒光，檢測制備的多克隆抗體的免疫效果，以期為后續(xù)的功能研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株、質粒、細胞和主要試劑

DH5α感受態(tài)細胞、真核表達質粒pCAGGS-P7以及人肺癌A549細胞為湖南師范大學心臟發(fā)育中心保存；BALB/c小鼠購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司；高保真酶試劑盒、一步克隆試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司；DNA純化回收試劑盒、質粒提取試劑盒購自北京康為世紀生物公司；鼠二抗購自CST公司。限制性內切酶KpnI、XhoI(Takara公司，日本)；常規(guī)RPMI1640培養(yǎng)基(北京全式金生物技術有限公司)；10%新生牛血清FBS(Invitrogen公司，美國)；10 mmol/L Hepes(北京索萊寶科技有限公司)，用于細胞培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2。

1.2 引物的設計與合成

在NCBI網站上搜索斑馬魚Asb11基因的cDNA序列，并以該序列為模板，利用Primer5.0軟件設計引物P1、P2。在P1、P2引物前均加入同源臂序列，同源臂序列中分別引入限制性內切酶KpnI、XhoI識別位點。引物由上海生物工程公司合成，序列如下(下劃線序列為內切酶KpnI、XhoI的識別位點)：P1(pCAGGS-P7-Asb11-F)：CTATAGGGCGAATTGGGTA CCTTTAGTTTAGAGATGGCCGTGG；P2(pCAGGS-P7-Asb11-R)：ATCGATACCGTCGACCTCGAGGTGACACT TGACAATGTTTATCGG。

1.3 pCAGGS-P7/ASB11表達質粒的構建

首先，用Trizol從發(fā)育至24 h的AB品系斑馬魚胚胎中提取總RNA，反轉錄合成cDNA。然后以cDNA為模板，用上述P1、P2引物進行高保真PCR擴增，成功擴增出長度為964 bp的Asb11基因片段。反應條件為：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性15 s，56 ℃復性15 s，30個循環(huán)，72 ℃延伸30 s，4 ℃保存。獲得的PCR產物瓊脂糖電泳后，用DNA純化回收試劑盒回收目的片段。最后與用限制性內切酶KpnI和XhoI雙酶切pCAGGS-P7質粒回收的約5 000 bp片段，用T4 DNA連接酶4℃連接過夜。

1.4 轉化及重組質粒的鑒定

將上述連接產物轉化至DH5α感受態(tài)細胞，經氨芐青霉素抗性篩選后，挑取陽性單克隆至氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基中，200 r/min，37 ℃振蕩培養(yǎng)14 h。以P1、P2為引物進行菌液擴增，經瓊脂糖凝膠電泳后初步確定重組質粒pCAGGGS-P7/ASB11陽性克隆，將陽性的重組質粒進行測序鑒定。

1.5 DNA免疫技術制備小鼠抗ASB11抗體

用pCAGGGS-P7/ASB11重組質粒免疫6～8周齡的小鼠：電擊處理5只小鼠后，在其肢股四頭肌部位注射濃度為700 ng/μL的重組質粒，每只小鼠注射40 μL。同時用未插入片段的pCAGGGS-P7空載質粒DNA等量注射5只小鼠作為對照組。注射時間段為0 d、21 d、28 d，共重復注射三次，于第35 d取血并分離血清，分裝后的血清于-80 ℃冰箱保存。

1.6 Western-blot檢測ASB11多克隆抗體效價

將發(fā)育至24 h的AB型斑馬魚胚胎收集于1.5 mL的EP管中，加入裂解試劑(RIPA)和蛋白酶抑制劑后充分研磨，在4 ℃搖床靜置30 min后，沸水煮10 min，轉速為12 000 r/min，離心5 min；取上清，加入5×的蛋白上樣Loading，12 000 r/min，離心2 min。然后取30 μL的樣品，SDS-PAGE凝膠電泳2 h，凝膠半干轉膜15 min，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入DNA免疫產生的ASB11抗血清作一抗，用免疫前血清做陰性對照，37 ℃搖床孵育2 h。最后，用TBST洗滌3次后加入1∶1 000抗小鼠的二抗，室溫孵育2 h，TBST洗滌3次后顯影觀察。

1.7 免疫熒光檢測ASB11多克隆抗體效價

將人肺癌A549細胞以合適的密度接種于玻底培養(yǎng)皿培養(yǎng)48 h，吸去培養(yǎng)基，PBS清洗2次，3 min/次；用4%多聚甲醛室溫固定20-30 min，PBS洗3次，5 min/次；然后用0.2%的Triton-X-100室溫通透20 min，PBS清洗3次，5 min/次；加入5%BSA封閉液，室溫封閉30 min后，吸掉封閉液。

實驗組用DNA免疫產生的ASB11抗血清1∶50稀釋，室溫孵育2 h，對照組則用等體積的免疫前血清孵育。在避光條件下，用0.1%的PBST洗3次后，滴加稀釋好的熒光二抗，室溫孵育2 h，PBST浸洗3次，5 min/次。滴加DAPI孵育10 min(DAPI按1∶1 000稀釋)，PBST洗3次，5 min/次，在共聚焦顯微鏡或熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

2 結果與分析

2.1 真核表達質粒pCAGGS-P7/ASB11的構建及鑒定

以P1、P2引物PCR擴增后得到約964 bp的目標條帶，對PCR產物進行純化(圖1)。然后將目標片段連接到pCAGGGS-P7質粒的KpnI和XhoI酶切位點之間，構建重組質粒pCAGGGS-P7/ASB11(圖2)。將重組質粒進行轉化后獲得單克隆菌液，提取質粒，進行酶切初步驗證(圖3)，并將質粒進行測序，進一步確定重組質粒序列的準確性。結果表明pCAGGGS-P7/ASB11重組質粒的序列與NCBI上ASB11序列一致，pCAGGS-P7/ASB11重組質粒構建成功。

圖1 Asb11基因的PCR產物純化回收電泳圖Fig.1 Electropherogram of purification and recovery of Asb11 PCR productsM：DNA marker； 1，2：Asb11基因PCR產物純化回收電泳條帶M:DNA marker;1, 2: Asb11 gene PCR product purification and recovery of electrophoretic bands

圖2 pCAGGGS-P7/ASB11重組質粒示意圖Fig.2 Construction of pCAGGGS-P7/ASB11 recombinant plasmid

圖3 pCAGGGS-P7/ASB11重組質粒酶切驗證圖Fig.3 Verification of pCAGGGS-P7/ASB11 recombinant plasmid digestionM：DNA Marker；1-9：Kpn I、Xho I酶切質粒結果；2、3、5、7、8、9號泳帶為與預期目的條帶大小相近的條帶M:DNA marker;1-9: Plasmid digestion results: the bands 2, 3, 5, 7, 8, and 9 are similar to the size of the intended destination band

2.2 ASB11多克隆抗體的Western-blot鑒定

提取發(fā)育至24 h的AB型斑馬魚胚胎總蛋白進行Western-blot檢測。將制備的ASB11多克隆抗體作為一抗，分別以1∶100和1∶400的稀釋比進行孵育，結果顯示免疫后血清在32 kD處有一條特異的雜交帶出現，并且稀釋比為1∶400時雜交信號仍然非常明顯(圖4)。這些結果說明免疫后的小鼠血清中產生了ASB11蛋白的特異性抗體，該抗體的特異性和敏感性良好，可以滿足后續(xù)相關實驗的需要。

圖4 ASB11多克隆抗體Western blot鑒定Fig.4 Western-blotting of ASB11 polyclonal antibody1：免疫前血清； 2：抗體稀釋比為1∶100； 3：抗體稀釋比為1∶4001:Control;2:The antibody dilution ratio: 1∶100;3:The antibody dilution ratio: 1∶400

2.3 ASB11多克隆抗體免疫熒光鑒定

免疫熒光實驗表明，DNA免疫制備的ASB11抗血清檢測人肺癌A549細胞中有較強特異性熒光，而陰性對照無明顯的特異性熒光(圖5)，即DNA免疫產生的ASB11多克隆抗體能夠識別自然狀態(tài)下的ASB11蛋白。

圖5 免疫熒光檢測多克隆抗體的特異性Fig.5 Detection of polyclonal antibodies specificity by immunofluorescenceA：免疫前血清免疫的細胞核染色；B：免疫前血清免疫的ASB11蛋白；C：免疫前血清免疫的merge圖；D：ASB11多克隆抗體免疫的細胞核染色；E：ASB11多克隆抗體免疫的ASB11蛋白的表達；F：ASB11多克隆抗體免疫的merge圖A: Nuclear staining of serum immunization before immunization;B: Expression of ASB11 protein in serum before immunization;C: Merge diagram of serum immunization before immunization;D: Nuclear staining immunized with ASB11 polyclonal antibodies;E: Expression of ASB11 protein immunized with ASB11 polyclonal antibody;F: Merge diagram immunized with ASB11 polyclonal antibody

3 討論

Asb11在脊椎動物中高度保守，研究表明，Asb11在多能和神經定向祖細胞系中的過度表達將抑制末梢神經元的分化；目前Asb11在胚胎發(fā)生和成體中的功能仍未得到充分的闡明。值得注意是，斑馬魚的Asb11不僅與人類的ASB11具有同源性，而且與哺乳動物中ASB家族的其它成員也高度同源，尤其是與ASB9高度同源。ASB9在結直腸癌中高度表達，是癌細胞檢測中的重要指標[20]，ASB11與ASB9高度同源，暗示ASB11可能參與了腫瘤的發(fā)生；泛素-蛋白酶體途徑是惡性腫瘤發(fā)生過程中的關鍵因子，在ASB11過表達的細胞系中，P53、P21的表達明顯上調[10]，由此推測ASB11可能與腫瘤的發(fā)生相關。有關ASB11的功能研究將有助于闡明胚胎神經祖細胞的發(fā)育、再生性肌發(fā)生、泛素化以及腫瘤的發(fā)生機理，具有重要的意義。

Wolf等人[19]第一次將DNA質粒注射到肌肉中，誘發(fā)免疫應答產生特異性抗體，開啟了DNA免疫的新篇章。作為近三十年發(fā)展起來的新興免疫技術，DNA免疫技術能很好的模擬天然條件下宿主機體感染病原體產生抗體的過程。劉麗梅[18]等人利用DNA免疫技術，通過將含有雞的β-actin真核啟動子和SV40雙啟動子的真核表達載體pCAGGS-P7/NV2B免疫小鼠，使下游插入的基因能在小鼠體內高效表達，制備了抗登革熱病毒2型NS2B蛋白的多克隆抗體;姜永萍[17]等人利用表達載體pCAGGS顯著增強了禽流感DNA疫苗的免疫保護效果;證明DNA免疫反應持久，可持續(xù)表達低水平的蛋白抗原。此外，DNA免疫可以直接免疫小鼠，其操作過程簡單、用時短、無需純化蛋白，故較傳統(tǒng)的免疫方式而言具有很大的優(yōu)勢。當然DNA免疫亦存在一定的缺陷，如免疫應答不夠強烈，所獲得的抗體效價也偏低等?？傮w來說，DNA免疫是一種簡單易行的抗體制備方法，尤其適用于分子質量小、不易純化的蛋白的抗體制備。

本研究通過反轉錄的方式獲得了斑馬魚ASB11的cDNA，將其克隆至改造過的含有雞β-actin啟動子和CMV增強子的pCAGGS-P7真核表達載體上，構建pCAGGS-P7/ASB11重組表達質粒。實驗表明，該重組質?？梢栽谛∈篌w內高效表達，肌肉注射較其他注射方法而言更為簡便，能誘導CTL特異反應。通過DNA免疫技術成功制備了斑馬魚Asb11基因的多克隆抗體，利用Western-blot以及免疫熒光檢測了ASB11多克隆抗體的有效性。在前期成功構建了斑馬魚Asb11基因突變品系的基礎上，為后續(xù)ASB11基因的功能研究和作用機理研究奠定了基礎。