張 文，黃德球，郭周義，陳曉峰

(1.華南師范大學(xué) a. 腦科學(xué)與康復(fù)醫(yī)學(xué)研究院； b.生物光子學(xué)研究院, 廣東 廣州 510631； 2.華南理工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510641)

近年來，越來越多的研究表明免疫系統(tǒng)在骨重建過程中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用[1-3]。免疫系統(tǒng)和骨骼系統(tǒng)密切相關(guān)，它們共享許多細胞因子、受體、信號分子和轉(zhuǎn)錄因子等。骨修復(fù)材料植入宿主體內(nèi)后即可激發(fā)機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，并可通過調(diào)控免疫系統(tǒng)來影響骨缺損的愈合和修復(fù)過程。如果材料引發(fā)過度的炎癥性免疫反應(yīng)將導(dǎo)致纖維囊的形成，妨礙成骨細胞附著到植入材料上，并最終導(dǎo)致骨修復(fù)失敗[4]；反之，材料引發(fā)的有益炎癥反應(yīng)將增強骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)的募集和向成骨分化，促進骨修復(fù)[5]。因此，骨修復(fù)材料的開發(fā)也從以往的免疫“惰性”材料向免疫調(diào)節(jié)型材料發(fā)展，賦予材料有益的骨免疫調(diào)節(jié)性能，將有利于進一步誘導(dǎo)成骨和骨整合[6]。

在眾多的免疫細胞中，巨噬細胞由于具有高度的功能可塑性，常被用作免疫細胞中的模型細胞。巨噬細胞是最重要的免疫細胞，在免疫應(yīng)答中起著重要作用。在不同的微環(huán)境條件刺激下，巨噬細胞可向M1和M2兩種不同表型極化并分泌出不同的細胞因子[7-9]。其中M1型巨噬細胞主要分泌促炎因子，不利于成骨分化；而M2型巨噬細胞主要產(chǎn)生抑炎因子，此外，還可通過分泌各種生長因子如骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β、血小板衍生生長因子(PDGF)等來調(diào)節(jié)成骨[10-12]。因此，通過調(diào)控巨噬細胞及時地從M1型向M2型的轉(zhuǎn)換將有利于形成有利的成骨免疫微環(huán)境，從而進一步促進成骨[13]。

生物活性玻璃(bioactive glasses，BG)由于具有良好的生物相容性，優(yōu)異的骨修復(fù)性能，在骨修復(fù)中的應(yīng)用廣泛[14,15]。尤其是近年來微納米生物活性玻璃(micro/nano bioactive glasses，MNBG)的研發(fā)，解決了傳統(tǒng)熔融法BG和溶膠-凝膠法BG易于團聚的缺點，并具有更高的比表面積和生物活性，有望于更好地應(yīng)用于骨修復(fù)中[16-20]。BG在植入體內(nèi)后通常會在降解過程中釋放出硅(silicon，Si)，鈣(calcium，Ca)和磷(phosphorus，P)等生物活性離子，這些離子在促進成骨分化中具有重要的作用[21]。鍶(strontium，Sr)是具有促進成骨和抑制破骨雙重作用的一種微量元素[22]，且Sr還具有顯著的抗炎作用[23]。為了進一步增強BG的促成骨分化作用，在MNBG中摻入Sr元素制備成新型免疫調(diào)控型材料摻鍶微納米生物活性玻璃(strontium-substituted micro/nano bioactive glasses，Sr-MNBG)，可以達到更優(yōu)的成骨效果。為了驗證以上假設(shè)，本文制備了不同摻鍶量的Sr-MNBG，并通過體內(nèi)外實驗研究了這些材料是否能具有免疫調(diào)控作用，并通過免疫調(diào)控產(chǎn)生有利的成骨微環(huán)境，從而促進成骨。

1 實驗

1.1 材料制備

本研究所使用的Sr-MNBG為以十二胺為催化劑和模板劑，結(jié)合溶膠凝膠法和模板法制備而成。通過以硝酸鍶為Sr來源，以Sr替代MNBG中不同摩爾百分比的Ca，得到摻Sr量分別為0%，5%，10%和15%的Sr-MNBG。具體制備過程參考本課題組前期的文獻報道[24]。

1.2 巨噬細胞極化研究

本研究所使用的RAW264.7巨噬細胞和小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(mMSCs)購買自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞庫。不同摻Sr量Sr-MNBG對巨噬細胞極化的影響采用流式細胞儀(Guava Easycyte HT)對M1/M2巨噬細胞表面標記分子進行檢測。不同摻Sr量的Sr-MNBG作用于巨噬細胞3 d后，收集細胞培養(yǎng)上清，離心去沉淀后凍于-80 ℃用于后續(xù)研究。收集巨噬細胞，清洗重懸后置于冰上，分別與M1型巨噬細胞表面標記分子CD11c，M2型巨噬細胞表面標記分子CD206一抗孵育60 min，離心清洗后與二抗冰上孵育30 min，再次離心清洗后重懸于PBS中上機檢測。所得數(shù)據(jù)使用Guavasoft 2.5軟件進行分析。

1.3 巨噬細胞調(diào)控液促成骨分化作用研究

mMSCs以5.0×104每孔的密度接種于24孔板，將1.2中所得的巨噬細胞培養(yǎng)上清按照1∶2的比例與DMEM完全培養(yǎng)基混合后加入到mMSCs中，通過培養(yǎng)14 d時的茜素紅染色和培養(yǎng)7 d時的實時熒光定量PCR(RT-PCR)研究其對mMSCs成骨分化的影響。

茜素紅染色的步驟如下：配制0.5%茜素紅染色液，調(diào)pH值至4.2。取出待染色的24孔板，PBS清洗后加入4%多聚甲醛固定20 min。染色前用超純水清洗后加入適量染色液，搖動孵育5 min后用超純水洗至上清無色，空氣中晾干并于倒置顯微鏡下觀察拍照。

RT-PCR的步驟如下：mMSCs的總RNA提取通過美基生物的Hipure Total RNA Kits來完成。使用TaKaRa公司的PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，最后使用Thermo公司的Maxima SYBR Green試劑盒在10 μL體系下進行RT-PCR操作檢測成骨相關(guān)基因表達。通過2-△△CT法，以GAPDH為看家基因計算細胞中基因表達的相對水平。本研究所用引物如表1所示。RT-PCR和細胞實驗均重復(fù)三次，使用SPSS Statistics version 22(IBM, USA)統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，ANOVA及LSD檢驗進行組間比較，P值<0.05 表示統(tǒng)計學(xué)差異具有顯著性。

1.4 原位骨缺損修復(fù)實驗研究

實驗所需SD大鼠購自廣東藥科大學(xué)動物實驗中心，分為4組，每組8只。戊巴比妥納麻醉后，常規(guī)消毒腿部皮膚，用手術(shù)刀在大腿內(nèi)側(cè)做一個1 cm的切口，分離皮下組織和肌腱，暴露股骨內(nèi)側(cè)髁。使用電動牙科鉆在股骨內(nèi)側(cè)髁鉆一個直徑為3 mm，深3 mm的圓柱形孔。填入不同摻Sr量的Sr-MNBG后縫合肌肉和皮膚，并于術(shù)后三天使用紅霉素軟膏，防止傷口感染。分別于術(shù)后7天和28天處死大鼠，取股骨，用10% EDTA脫鈣處理30 d后，包埋切片，進行免疫組化染色和Masson染色。免疫組化染色中使用iNOS表征M1型巨噬細胞，精氨酸酶表征M2型巨噬細胞。

表1 本研究中RT- qPCR 的引物設(shè)計Tab.1 Primer design used in the RT-qPCR

2 實驗結(jié)果與討論

2.1 不同摻Sr量Sr-MNBG對巨噬細胞極化的影響

圖1是流式細胞儀檢測RAW264.7巨噬細胞分別在0%Sr-MNBG、5%Sr-MNBG、10%Sr-MNBG和15%Sr-MNBG作用后表面標記分子表達情況，其中M1型巨噬細胞的表面標記分子為CD11c，M2型巨噬細胞的表面標記分子為CD206。從圖中可以看出，與0%Sr-MNBG相比，巨噬細胞在5%Sr-MNBG、10%Sr-MNBG和15%Sr-MNBG的作用下，其細胞膜表面均表達更少的M1表面標記分子CD11c，表達更多的M2表面標記分子CD206，此結(jié)果表明摻入Sr可以促進MNBG調(diào)控巨噬細胞向M2極化的作用，且10%Sr-MNBG具有最佳的作用效果。這可能與Sr的摻入量有關(guān)，過低的摻鍶量不足以達到促進巨噬細胞M2極化的作用，而過高的摻鍶量也可能導(dǎo)致巨噬細胞向M2極化的能力受限。因此，適宜的摻鍶量才能夠調(diào)控最佳的巨噬細胞M2極化效果。

2.2 Sr-MNBG調(diào)控的巨噬細胞分泌成分對mMSCs成骨分化的影響

將0%Sr-MNBG、5%Sr-MNBG、10%Sr-MNBG和15%Sr-MNBG調(diào)控巨噬細胞條件培養(yǎng)液用于mMSCs的培養(yǎng)，研究材料調(diào)控的巨噬細胞分泌成分對成骨分化的影響。各組的條件培養(yǎng)液與mMSCs共培養(yǎng)14 d后，進行茜素紅染色，結(jié)果如圖2所示，與0%Sr-MNBG組相比，其他組均有更多的礦化結(jié)節(jié)形成，其中10%Sr-MNBG組形成的礦化結(jié)果最多。此外，mMSCs與各組的條件培養(yǎng)液共培養(yǎng)7 d后，其成骨分化基因的表達結(jié)果如圖3所示。與0%Sr-MNBG組相比，5%Sr-MNBG、10%Sr-MNBG和15%Sr-MNBG的成骨分化基因表達均有不同程度表達上調(diào)，且具有顯著性差異。上調(diào)程度10%Sr-MNBG組>15%Sr-MNBG組>5%Sr-MNBG組>0%Sr-MNBG組。結(jié)合茜素紅染色和基因表達的結(jié)果來看，不同摻鍶量的Sr-MNBG誘導(dǎo)的巨噬細胞極化后所分泌的因子均可一定程度促進成骨分化，且10%Sr-MNBG組誘導(dǎo)的巨噬細胞分泌成分具有最好的促成骨效果。

圖1 巨噬細胞在不同摻鍶量Sr-MNBG作用下的流式細胞結(jié)果Fig.1 Flow cytometry results of macrophage stimulated by Sr-MNBG)with 0, 5%, 10% and 15% molar percent of strontium element

圖2 巨噬細胞條件培養(yǎng)液與mMSCs共培養(yǎng)14 d后的茜素紅染色結(jié)果(所有標尺均為200 μm)Fig.2 Alizarin red S staining of mMSCs with macrophage-conditioned medium for 14 days (scale bar is 200 μm)

圖3 巨噬細胞條件培養(yǎng)液與mMSCs共培養(yǎng)7 d后的成骨分化基因表達(*P<0.05與0%Sr-MNBG組比較；#P<0.05與5%Sr-MNBG組比較；@P<0.05與10%Sr-MNBG組比較)Fig.3 Fold change of osteogenesis gene expression of mMSCs with macrophage-conditioned medium for 7 days (*P<0.05 vs 0%Sr-MNBG group;#P<0.05 vs 5%Sr-MNBG group;@P<0.05 vs 10%Sr-MNBG group)

2.3 原位骨缺損修復(fù)實驗驗證巨噬細胞極化和成骨作用

圖4和圖5為對骨缺損處組織進行免疫組化染色的結(jié)果，其中圖4為M1型巨噬細胞標記分子iNOS的表達情況，圖5為M2型巨噬細胞標記分子精氨酸酶的表達情況。從圖4中可看出，0%Sr-MNBG組骨缺損周圍M1型巨噬細胞浸潤最多，而10%Sr-MNBG組M1型巨噬細胞浸潤最少。從圖5中可以看出M2型巨噬細胞標記分子的表達呈現(xiàn)出與M1型巨噬細胞相反的趨勢，即0%Sr-MNBG組具有最少的M2巨噬細胞浸潤，10%Sr-MNBG具有最多的M2巨噬細胞浸潤。這些結(jié)果說明摻鍶的Sr-MNBG的植入能夠促進巨噬細胞向M2極化，其中10%Sr-MNBG具有最佳的促巨噬細胞M2極化作用，與體外細胞實驗結(jié)果相符。

圖4 巨噬細胞M1極化標記分子winos免疫組化染色(所有標尺均為200 μm)Fig.4 Immunohistochemical staining of M1 macrophage marker iNOS (scale bar is 200 μm)

圖6 Sr-MNBG植入28天后骨缺損處的Masson染色(所有標尺均為200 μm)Fig.6 Masson staining of bone defect after the implantation of Sr-MNBG for 28 days (scale bar is 200 μm)

通過對不同摻鍶量Sr-MNBG植入體內(nèi)后28天的骨修復(fù)效果進行Masson染色檢測，結(jié)果如圖6所示：10%Sr-MNBG組形成了更多的新生骨，表現(xiàn)出更好的成骨效果，與體外細胞實驗相一致。

3 總結(jié)

本文制備了0%，5%，10%和15%的鍶摻雜微納米生物活性玻璃，并通過體內(nèi)外實驗研究了不同摻鍶量的Sr-MNBG對巨噬細胞極化的影響及其極化后的巨噬細胞對成骨分化的影響。體內(nèi)外研究的結(jié)果均顯示不同摻鍶量的Sr-MNBG均具有促進巨噬細胞向M2極化的作用，且巨噬細胞M2極化后的分泌因子可進一步促進成骨分化，其中10%摻鍶量的MNBG具有最好的促巨噬細胞M2極化效果。我們在以往的研究中也證明了摻鍶的亞微米生物活性玻璃能夠通過促進巨噬細胞適度的M2極化來進一步誘導(dǎo)成骨[24]，但是尚未對鍶的摻雜量進行優(yōu)化，本研究制備了一系列不同鍶摻雜量的MNBG，通過比較分析不同摻鍶量MNBG對巨噬細胞極化的作用，得出了誘導(dǎo)巨噬細胞M2極化的最佳鍶摻雜量。以往對摻鍶磷酸鈣影響炎癥因子分泌的研究中發(fā)現(xiàn)鍶元素在高濃度和低濃度時均能抑制促炎因子TNFα的分泌，而對炎癥因子IL6的分泌具有濃度依賴的抑制作用，高濃度時促進IL6的分泌，低濃度時抑制IL6的分泌[25]。本研究的結(jié)果也表明了鍶元素的摻雜量并非越高越好，適度的鍶元素摻雜更能誘導(dǎo)最佳的成骨免疫微環(huán)境。通過本研究，我們進一步證實了巨噬細胞極化在骨修復(fù)進程中所發(fā)揮的重要作用，通過對材料進行組分調(diào)整，也可作用一種調(diào)控免疫反應(yīng)的良好策略。經(jīng)過優(yōu)化的適宜摻鍶量的Sr-MNBG也有望作為一種具有有益骨免疫調(diào)控功能的骨修復(fù)材料應(yīng)用于骨修復(fù)。