尹麗陽，羅世鋒，陳 宇，漆軻婧，彭 云，萬永奇，吳秀山，李永青

(湖南師范大學省部共建淡水魚類發(fā)育生物學國家重點實驗室，教育部重點實驗室，生命科學學院心臟發(fā)育研究中心，湖南 長沙410081)

生物信息學分析顯示ASB11蛋白在N-末端有6個串聯(lián)重復的錨蛋白結構域和1個在C-末端的SOCS箱形結構域[1]。ASB11蛋白是調控Delta-Notch信號的元件，以一種細胞非自主性機制調節(jié)DeltaA與Notch之間的側抑制，是Delta-Notch信號至關重要的調節(jié)因子[2]。近年來有研究表明，Asb11在斑馬魚胚胎發(fā)育的終端分化過程中表達下調，且對于外胚層譜系分布范圍具有潛在的調節(jié)作用，并表明Asb11的表達是肌肉祖細胞擴增所必須的，而其表達下調標志著終端分化的開始[3,4]。隨后也有證據(jù)表明，Asb11是胚胎發(fā)育和成體肌肉再生的主要調節(jié)者[5]。

本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，Asb11基因包含的兩個2.9 kb和5.0 kb轉錄本在心肌和骨骼肌中特異性表達[6]；前人研究表明斑馬魚Asb11基因與Notch信號通路的激活有關，而Notch信號通路與斑馬魚心臟的瓣膜及流出道的發(fā)育有關。因此，本文作者推測Asb11基因也是一種與心臟發(fā)育相關的候選基因，其對于心臟的發(fā)育可能有重要的調節(jié)作用，且其可能通過Notch信號途徑調控心臟的發(fā)育。

作為近年來興起的基因編輯技術，CRISPR/Cas9是細菌演化過程中形成的一種適應性免疫防御機制，可用來對抗外來入侵的病毒及DNA[7-9]。前人研究中將CRISPR/Cas9分為3種類型，其中Ⅱ型中的Cas9能夠識別一種非編碼RNA(sgRNA)，從而對靶向dsDNA序列進行定點切割[10]。因此，本文利用CRISPR/Cas9打靶技術對斑馬魚Asb11基因進行基因敲除。首先經網站分析篩選出Asb11基因最適合的打靶位點，通過PCR擴增出用于轉錄Asb11基因的CRISPR/Cas9打靶gRNA的雙鏈DNA模板，再將Asb11基因的gRNA和Hcas9的mRNA都轉錄出來，混合后共同注射到斑馬魚胚胎Ⅰ細胞期胚胎中。在顯微注射后，對Asb11基因CRISPR/Cas9打靶的F0代進行有效性檢測，發(fā)現(xiàn)在斑馬魚Asb11基因的第一號外顯子出現(xiàn)了5個和8個堿基的缺失，證明CRISPR/Cas9 系統(tǒng)對Asb11基因的敲除是有效的。進一步對其F0代、F1代和F2代進行篩選，成功獲得Asb11基因敲除的斑馬魚品系。這些工作為探究Asb11在心臟發(fā)育中的作用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌感受態(tài)菌株E.coli：Top10 以及DH5α，克隆T載體(PMD18-T)，本實驗所有的野生型斑馬魚AB品系(所獲得胚胎均在28.5 ℃恒溫E3水中進行孵育)，DNA膠純化和回收試劑盒，T7轉錄試劑盒，質?？焖偬崛≡噭┖?，顯微注射儀，RNA Cycle Pure kit等。

1.2 方法

1.2.1 Crispr打靶位點的選擇

從Esembl(http:// www.ensembl.org / index.html)網站上獲取目標基因的完整序列，各個轉錄本以及外顯子和內含子等信息；并選取其中序列大小合適的外顯子(一般優(yōu)先選取1號外顯子)，再在NCBI(http://www.Ncbi.Nlm.Nih.gov/)網站上Blast其序列是否單一正確。然后用網上軟件( http://www.genome-engineering.org / crispr/? page_id=41)進行打靶位點的設計選擇，從中選取評分最高、最合適的靶標位點。

1.2.2 靶標序列gRNA的合成

根據(jù)國家斑馬魚資中心的資料可知，科學家已將 gRNA 的骨架序列克隆至PMD19-T 載體中，并命名為 p42250 質粒(如圖1所示)。運用1.2.1所述網站設計合成的gRNA以P42250質粒(gRNA骨架載體)為模板進行PCR擴增，將擴增后得到的序列進行PCR產物膠純化回收，用T7轉錄酶系統(tǒng)對純化回收后的PCR序列進行體外轉錄成mRNA，再用RNA純化試劑盒對mRNA純化回收，保存于-80 ℃冰箱。

1.2.3 Cas9的合成與制備

用XbaⅠ將mRNA Cas9的模板h-Cas9質粒酶切線性化，經過DNA膠純化回收試劑盒進行純化回收，用RNase Free H2O 溶解回收于RNase Free 的EP管中。使用T7 Ultra Kit (Ambion，AM1345) 進行體外轉錄成mRNA，再用RNA純化試劑盒對mRNA純化回收，保存于-80 ℃冰箱。

1.2.4 斑馬魚胚胎顯微注射及有效性檢測

收取斑馬魚胚胎，待其發(fā)育至Ⅰ細胞期時排列整齊于注射板上，用半自動注射儀將提前混合好的hCas9 mRNA和gRNA(二者的混合按一定的濃度比：hCas9 mRNA∶300 ng/μL，gRNA∶20 ng/μL；)共同注射其中。同時收取同缸產的野生型胚胎進行對照，置于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h至72 h，期間收取1/3注射過后的胚胎及WT的胚胎進行有效性檢測，提取其基因組，然后進行PCR擴增，測序檢測。

1.2.5 斑馬魚F0、F1、F2代基因型鑒定

胚胎有效性檢測為陽性后，將該批斑馬魚培養(yǎng)至3個月左右成熟，對單個個體斑馬魚剪尾提取基因組，PCR后測序分析，對于測序結果為雙峰的個體，進行PMD18-T載體連接轉化，再進行測序分析，從而獲得有缺失的突變個體即F0代。將F0代與WT雜交，獲得F1代，剪尾提取基因組DNA，進行PCR，產物進行測序分析，獲得可穩(wěn)定遺傳的F1代。F1代雄性雜合體與F1代雌性雜合體雜交，可獲得F2代純合突變體，然后進行PCR和測序檢測分析。

圖1 p42250質粒示意圖Fig.1 The picture of p42250 plasmid

圖2 Asb11基因靶標位點示意圖Fig.2 The design diagram of Asb11 gene targeting site注: 以上序列是 Asb11基因序列的一部分，加粗部分是 1 號外顯子;未加粗的是內含子;下劃線為直線的表示靶標序列;下劃線為雙直線的表示 PAM 序列;陰影部分為檢測引物，綠色為兩對引物重疊部分。Note:The above sequence is a partial sequence of the Asb11 gene;the bold part is exon 1;the un-enhanced portion is an intron;“ ”: the target sequence;“ ” : the PAM sequence;shadow region: the primers for detection;green region: the overlap of two pairs primers.

2 結果

2.1 Asb11基因靶位點的選擇

按1.2.1所述的方法在Asb11基因1號外顯子上擇優(yōu)選取打靶位點，將保護堿基 tg 和 T7 啟動子加在設計好的靶位點序列前面，gRNA骨架的上游序列加在靶位點后面，將此作為正向引物序列，命名為：Asb11-gRNA-F1；以gRNA骨架的下游序列為反向引物，即Asb11-Cas-R (如表1) 。

2.2 Asb11基因gRNA和CAS9 mRNA的合成

將按1.2.2中所述方法設計好的靶標gRNA序列送鉑尚公司合成后，用XbaⅠ酶切線性化的p42250質粒為模板，以Asb11-gRNA-F1為正向引物，Asb11-Cas-R作為反向引物進行PCR擴增(凝膠電泳結果如圖3)。將PCR產物純化回收后，以T7體外轉錄系統(tǒng)進行體外轉錄成mRNA，隨后純化回收(圖4所示)；hCas9 mRNA也是以線性化的p42250質粒為模板體外轉錄獲得，純化回收后均 保存于-80 ℃。

表1 gRNA及引物序列列表Tab.1 gRNA and primers list

注: 其中 Asb11-gRNA-F1是gRNA 正向引物;tg是保護堿基;TAATACGACTCACTATA 是T7啟動子序列;下劃線部分是靶標序列;GTTTTAGAGCTAGAAATAGC 是gRNA 骨架上游序列;Asb11-Cas-R是gRNA反向引物;AAGCACCGACTCGGTGCCACT 是gRNA 骨架下游序列；Asb11-Exon1-S及Asb11-Exon1-AS，Asb11-F2-S和Asb11-F2-AS是檢測引物。
Note: Asb11-gRNA-F1: gRNA forward primer;Tg: the protecting base;TAATACGACTCACTATA: the T7 promoter sequence;“ ”: the target site sequence;GTTTTAGAGCTA GAAATAGC: the upstream sequence of the gRNA backbone sequence;Asb11-Cas-R: a gRNA reverse primer;AAGCACCGACTCGGTGCCACT: the downstream sequence of the gRNA back-bone sequence;Asb11-Exon1-S, Asb11-Exon1-AS, Asb11-F2-S, Asb11-F2-AS: the primers for detection.

圖3 Asb11基因gRNA 模板PCR擴增片段結果Fig.3 The PCR amplification results of Asb11-gRNAM:DNA marker;1、2:Asb11-gRNA-F1

圖4 Asb11基因gRNA體外轉錄純化結果Fig.4 The transcriptional purification results of Asb11-gRNAM:DNA marker;1、2:Asb11-gRNA-F1

2.3 Asb11基因打靶有效性檢測分析

由1.2.4所述的實驗方法將hCas9mRNA與Asb11-gRNA-F1在斑馬魚胚胎發(fā)育至Ⅰ細胞期時混合共同注射入胚胎中，將胚胎置于28 ℃下孵育48-72 h后隨機挑取8管，其中1管為野生型胚胎(對照)，每管大約5-10顆胚胎提取基因組，以其為模板，分別以Asb11-Exon1-S及Asb11-Exon1-AS為正反引物進行PCR擴增，凝膠電泳結果顯示PCR產物的大小約為400 bp(圖5所示)，與預期的387 bp相符。將PCR產物送測序分析，結果顯示在Asb11-gRNA-F1的靶位點處出現(xiàn)雙峰(結果如圖6)，提示該位點存在堿基的插入與缺失。

為了更明確Asb11-gRNA-F1注射的有效性，我們將注射的胚胎提基因組后純化回收PCR 產物與PMD18-T載體連接后轉化，挑10個左右單克隆菌落送測序，測序結果表明確實存在5 bp和8 bp堿基的缺失(如圖7)。進一步說明了Asb11-gRNA-F1注射是有效的。

2.4 Asb11基因打靶F0代突變體的篩選

檢測過打靶的有效性后，將注射了Asb11-gRNA-F1與hCas9的胚胎培養(yǎng)至3個月左右性成熟，養(yǎng)大的斑馬魚一共有21條，按編號Asb11-F0-1至Asb11-F0-21對其進行排序剪尾提基因組，并以其為模板，用引物Asb11-Exon1-S及Asb11-Exon1-AS進行PCR擴增，得到一條387 bp的條帶，回收PCR產物送測序，測序結果顯示Asb11-F0-3、5、8、9靶位點有雙峰，打靶效率為19.04%，其中Asb11-F0-8的測序結果如圖8所示。

圖5 PCR產物電泳結果示意圖Fig.5 The electrophoresis results of PCR productM:DNA marker;1-7:注射組1-7; 8:WT (野生型對照組)M:DNA marker;1-7:Injection group 1-7;8:WT (control group)

圖6 PCR 產物測序峰值圖Fig.6 PCR product sequencing peak results注：圖為正向測序峰值結果，黑色下劃線部分為Asb11-gRNA-F1靶標位點。Note:The picture is the result of forward direction sequencing peak map;“ ”: the target sequence of Asb11-gRNA-F1.

圖7 gRNA打靶區(qū)域序列與正常序列比對結果Fig.7 The BLAST comparison results of gRNA target sequence to the sequence of WT 注：黑色下劃線部分為Asb11-gRNA-F1靶標位點，黑色下劃線為三直線部分表示PAM序列Note:“ ”:the target sequence of Asb11-gRNA-F1;“ ”: the PAM sequence.

圖8 Asb11-F0-8 的 PCR產物測序峰值結果圖Fig．8 Asb11-F0-8 PCR product sequencing peak results注：黑色下劃線部分為Asb11-gRNA-F1靶標位點。Note:“ ”: the target sequence of Asb11-gRNA-F1.

通過對測序結果進行分析，我們將Asb11-F0-3、5、8、9這4個基因組PCR的純化產物與PMD18-T載體連接，之后轉化挑10個單克隆菌落送測序，并對測序結果進行比對，獲知Asb11-F0-9、3、5、8分別出現(xiàn)1個和2個堿基的插入，9個和14個堿基的缺失(如圖9)，由于9是3的倍數(shù)，因此Asb11-F0-5的敲除未達到目的。

2.5 穩(wěn)定性遺傳的檢測

為了驗證F0代個體是否能夠穩(wěn)定遺傳，我們將F0代嵌合體與野生型斑馬魚雜交得到F1代個體，培養(yǎng)至3個月左右性成熟，對F1代個體剪尾提基因組，以基因組DNA為模板進行PCR擴增，送測序；將測序結果為雙峰的PCR產物純化回收后連接PMD18-T載體克隆，挑單克隆測序比對分析結果見表2，結果顯示有3個突變類型能夠穩(wěn)定遺傳。

圖9 Asb11 F0代測序比對結果示意圖Fig.9 The blast of sequence results of Asb11 F0

表2 斑馬魚Asb11基因F1代突變體比對結果圖Tab.2 The blast results of zebrafish Asb11 gene mutant F1

注：Query：WT序列； Sbjct：測序序列。
Note:Query: WT sequence;Sbjct:Sequencing sequence.

2.6 F2代純合突變體的篩選

本文選擇缺失了14個堿基的Asb11-F1-1，插入了1個和2個堿基的Asb11-F1-2、Asb11-F1-3這3種F1代突變體建立穩(wěn)定遺傳的純合敲除品系。已經篩選到缺失了14個堿基的雄性和雌性F1代斑馬魚突變體，二者雜交后獲得大量胚胎，在適宜條件下培養(yǎng)胚胎至3個月左右性成熟，剪尾提取基因組鑒定。通過兩對檢測引物進行PCR擴增后的電泳結果及測序檢測分析(圖10所示)，已經獲得F2代雄性純合突變體。Asb11-F2-S和Asb11-F2-ASPCR擴增的條帶大小為181 bp，在Asb11-Exon1-S及Asb11-Exon1-AS為引物進行PCR擴增有大小為387 bp的條帶的情況下,若第二對引物PCR擴增無條帶，則表明為純合子(如圖11)。

圖10 PCR產物電泳結果Fig.10 The electrophoresis results of PCR product M:DNA marker;1-15:F2代個體;8: WT (野生型對照組)M:DNA marker;1-15:F2 generation fish; 8: WT (control group)

圖11 F2代純合突變體測序比對結果Fig.11 The blast of sequence results of homozygous F2 generation mutant

目前已對152條F2代進行了突變體的篩選，得到了24條純合突變體，均為雄性，尚未獲得雌性純合突變體。還有大量F2代小魚及胚胎正在培育中，將繼續(xù)篩查。

3 討論

CRISPR/Cas9基因編輯技術是繼ZFN、ES 細胞打靶和 TALEN 打靶等傳統(tǒng)技術后出現(xiàn)的第四種可應用于定點構建基因敲除大、小鼠動物模型的方法。它設計簡單，制作成本低；效率高、速度快；能特異性識別任意序列，無物種限制；毒性低且脫靶情況少，因而廣泛應用于基因定點修飾，在動物模型構建的應用上前景十分廣闊，目前已廣泛應用于生命科學領域的研究[11-17]。本文用CRISPR/Cas9基因編輯技術，也在斑馬魚胚胎的整體水平敲除了Asb11基因，成功地構建斑馬魚Asb11基因敲除穩(wěn)定遺傳系。

本實驗室的前期研究結果顯示Asb11基因在心肌和骨骼肌中特異性表達。Asb11基因在骨骼肌中的作用已經得到了很好的詮釋。已有的研究表明Asb11的表達是肌肉祖細胞擴增所必須的，而其表達下調標志終末分化的開始[3,4]，該基因還是成體肌肉再生的主要調節(jié)者[5]。但是Asb11基因在心臟發(fā)育中的功能尚不清楚。為此，本文用CRISPR/Cas9基因編輯的新技術構建斑馬魚Asb11基因敲除品系，通過PCR測序檢測分析已經成功獲得了可以穩(wěn)定遺傳的F2代突變體系。這一工作為深入探究該基因在心臟發(fā)育中的作用奠定了基礎。

在對F2代突變體的篩選中，本次研究僅獲得了該基因缺失14 bp的雄性純合突變體，并未篩選到雌性純合突變體。斑馬魚早期是雌雄同體，卵巢的發(fā)育是受精后10-20 d期間，隨后卵巢細胞開始凋亡，精巢開始發(fā)育，其性別分化被確定[18]。斑馬魚的性成熟需要3個月左右，在其胚胎發(fā)育階段，存在多個決定其性腺發(fā)育的基因；有研究顯示，斑馬魚的性別決定也是由多個基因協(xié)同調控芳香化酶基因的表達，使其活性降低或缺失，從而影響雌激素的分泌，導致卵巢的程序性死亡；而在這種情況下，睪丸細胞開始分化，斑馬魚的性別逐漸由雌性向雄性轉變[19,20]。對于本次研究中F2代純合突變體僅出現(xiàn)雄性的現(xiàn)象，較為合理的解釋有四種：1)實驗樣本基數(shù)過少。本研究已完成性別鑒定的斑馬魚152條，但純合子突變體只有24條，實驗基數(shù)還不夠大，須在后期的研究中增大F2代個體篩選的數(shù)目，以完全排除篩選基數(shù)少導致這種現(xiàn)象的可能性。2)在斑馬魚的養(yǎng)殖過程中，本文作者發(fā)現(xiàn)斑馬魚的養(yǎng)殖密度過大也可能會影響到其性別的分化,使得斑馬魚的性別由雌性向雄性轉化。后期需減小F2代斑馬魚個體的養(yǎng)殖密度，應按照合理的飼養(yǎng)密度不大于1Tail/L進行F2代斑馬魚的飼養(yǎng)，排除養(yǎng)殖密度對性別分化的影響。3)眾所周知，CRISPR/Cas9打靶技術仍然存在一定的脫靶率，所以在Asb11基因被敲除的情況下，也可能出現(xiàn)其他與斑馬魚性別決定相關的基因被敲除。因此，需對斑馬魚性別決定的相關基因進行鑒定、篩查或者進行全基因組測序，確定其他基因是否發(fā)生了移碼突變，從而影響了其性別的分化。4)Asb11基因可能參與了斑馬魚的性別發(fā)育，且在性別轉化過程中該基因是不可或缺的，即在斑馬魚性別分化過程中Asb11基因發(fā)揮著關鍵作用，正常表達的Asb11基因會保持斑馬魚性別轉化的穩(wěn)定性，使后代雌雄比例保持相對穩(wěn)定的狀態(tài)。一旦Asb11基因缺失，斑馬魚的性別分化機制可能發(fā)生紊亂，這種紊亂可能為斑馬魚雌性發(fā)育過程被阻斷，促使斑馬魚在性別分化過程中只能向雄性轉化。也可能為Asb11基因敲除后，啟動了卵巢細胞的凋亡機制，加速了卵巢細胞的凋亡進程，在此過程中精巢細胞發(fā)育過程不受影響，使得Asb11基因敲除后的F2代純合突變體均為雄性。只有確定F2代純合突變體的性別決定是否受其他因素的影響，才能進行進一步有關Asb11基因是否是斑馬魚性別決定相關基因的具體情況分析研究。