陳 曉，葛 雷，戴建軍*，李 麗，張德福，吳彩鳳，張樹山

(1.上海市農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，上海 201106；. 錦州醫(yī)科大學畜牧獸醫(yī)學院，錦州 121001；3. 上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點實驗室動物遺傳工程研究室，上海 201106)

羊口瘡是以山羊和綿羊為易感動物的高度傳染性人畜共患病，近年來打破地域界限，嚴重制約畜牧業(yè)經(jīng)濟發(fā)展[1]。該病由羊口瘡病毒(orf virus, ORFV)所致，為痘病毒科副痘病毒屬雙鏈線性DNA病毒[2]。ORFV編碼的許多毒力因子能夠在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮其干擾宿主的能力[3]，這種免疫逃避機制促使病程反復持續(xù)，盛行局面難以控制。在感染動物中除羊外，還包括馬鹿、羚羊、麝牛、駱駝、松鼠、海豹、犬貓以及人[4]。與患病動物或其污染物接觸感染后，病毒首先侵襲上皮細胞破壞其完整性，其次迅速完成復制，最終患處會出現(xiàn)菜花樣增生的典型病灶[5]。通常在口唇、外陰、蹄部可見水泡和膿皰破潰后形成的結(jié)痂病變[6]，痊愈后，宿主痂皮內(nèi)殘存的病毒顆粒仍保持感染力，可作為傳染源導致疾病再度復發(fā)。

目前ORFV的預防措施現(xiàn)仍以免疫弱毒疫苗為主，存在毒力返強的可能，且實際免疫效果并不是十分理想，因此新型疫苗的研制意義重大[7]。腺病毒載體系統(tǒng)作為重組腺病毒載體活疫苗應用研究的理想載體，其優(yōu)勢表現(xiàn)在感染能力強、宿主范圍廣、免疫方式多、載體容量大、病毒滴度高、安全性和免疫性好等諸多方面[8]。本研究從前期分離的ORFV上海株中擴增F1L和B2L保護性抗原基因，構(gòu)建串聯(lián)表達該雙基因的重組腺病毒，并通過小鼠免疫試驗初步評價其免疫特性，為ORFV新型疫苗的研發(fā)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞、病毒、主要試劑及實驗動物

腺病毒表達系統(tǒng)(含CMV啟動子、T2A、P2A肽及EGFP熒光蛋白等)、大腸桿菌stbl3株、HEK-293細胞和轉(zhuǎn)染試劑Polybrene均為廣州賽業(yè)生物科技有限公司產(chǎn)品；ORFV-F416上海分離株、MDBK細胞、羊抗ORFV血清由本實驗室保存；限制性內(nèi)切酶HindⅢ、XhoⅠ購自Thermo公司，限制性內(nèi)切酶PacⅠ購自NEW ENGLAND BioLabs；Alexa Fluor 647-兔抗山羊IgG購自Jackson ImmunoResearch；Mouse IgG ELISA Kit 購自上海研生實業(yè)有限公司；6～8周齡ICR雌性小鼠，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

1.2 引物設計與基因擴增

F1L和B2L基因的引物信息見表1。經(jīng)PCR擴增和測序，獲得ORFV-F416上海分離株的F1L和B2L基因序列。

表1 擴增F1L和B2L基因的引物序列

1.3 重組穿梭質(zhì)粒與重組腺病毒的構(gòu)建

F1L和B2L基因經(jīng)測序比對后，與腺病毒穿梭載體pAd-CMV、T2A、P2A和EGF基因連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)株，提取陽性克隆，將PCR、HindⅢ和XhoⅠ雙酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒命名pAd-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP。PacⅠ內(nèi)切酶線性化pAd-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP，與骨架質(zhì)粒pAdEasy-1轉(zhuǎn)入大腸桿菌stbl3感受態(tài)株實現(xiàn)同源重組并提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR、酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒命名pAdEasy-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP。該質(zhì)粒與Polybrene共轉(zhuǎn)染細胞融合度為70%～85%的HEK-293細胞，培養(yǎng)至細胞內(nèi)可見細胞病變效應(CPE)及大范圍的熒光綠團，-80 ℃反復凍融收獲重組病毒，命名為pAV-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP。同理，制備不含ORFV目的基因的重組腺病毒pAV-CMV-EGFP為對照。

1.4 重組腺病毒MDBK細胞內(nèi)擴增與滴度測定

pAV-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP和pAV-CMV-EGFP分別轉(zhuǎn)染MDBK細胞，待細胞出現(xiàn)CPE和綠色光團后反復凍融3次收毒，以3 000 r·min-1離心10 min取上清，并以10-1～10-10梯度稀釋病毒上清，接種于96孔板內(nèi)單層MDBK細胞，每個稀釋度對應縱排8個孔，末端兩縱排為對照孔，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)吸附2 h后，棄上清補加5% FBS的細胞維持液，于相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)5 d，按Karber 法測定病毒液效價。

1.5 重組腺病毒表達后檢測

1.5.1 重組腺病毒F1L、B2L基因檢測 使用病毒基因組試劑盒提取重組腺病毒(pAV-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP、pAV-CMV-EGFP)DNA，PCR鑒定目的基因。

1.5.2 重組腺病毒間接免疫熒光(IFA)檢測 轉(zhuǎn)染后的MDBK細胞經(jīng)固定、透化、封閉、一抗(羊抗ORFV血清)、二抗(Alexa Fluor 647-兔抗山羊IgG)孵育及清洗干燥后，熒光顯微鏡下觀察熒光生成情況。

1.6 重組腺病毒免疫小鼠及免疫效果評價

1.6.1 小鼠免疫接種 將20只ICR雌性小鼠隨機分2組，每組10只，分別在同一位置肌內(nèi)注射ORFV重組腺病毒和PBS。初免后間隔2周實施二免。免疫方案見表2。各組小鼠在0～5周斷尾采血，分離所獲血清經(jīng)56 ℃ 30 min滅活，-20 ℃存放備用。

表2 小鼠免疫方案

1.6.2 免疫小鼠IgG抗體水平檢測 使用小鼠IgG ELISA定量檢測試劑盒檢測免疫0～5周小鼠的IgG抗體水平。通過標準物質(zhì)量濃度(800、400、200、100、50 ng·mL-1)與OD值計算標準曲線的直線回歸方程。

1.6.3 免疫小鼠MTT法測定脾淋巴細胞增殖 每組各取二免后第3周小鼠2只，頸椎脫臼處死，無菌分離脾制備小鼠脾淋巴細胞懸液。用RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為2×105·mL-1，以每孔100 μL接入96孔板內(nèi)，培養(yǎng)孔內(nèi)各加入50 μL 刀豆素(ConA 5 μg·mL-1)、50 μL滅活ORFV及50 μL RPMI-1640培養(yǎng)液，每孔各3個重復，另設3個空白對照孔。各孔混勻后于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，在臨結(jié)束前4 h加入10 μL MTT(5 mg·mL-1)繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，每孔加入100 μL Formanzan溶液，培養(yǎng)箱內(nèi)再次孵育4 h，用酶標儀在570 nm處測定各孔的OD值。

1.6.4 小鼠攻毒試驗 2組小鼠在第5周使用ORFV-F416毒株細胞上清液(1×105.6TCID50)進行攻毒試驗，每只皮下接種500 μL，另取同期飼養(yǎng)的健康小鼠作為空白對照。逐日觀察小鼠的精神狀態(tài)，并記錄各組小鼠發(fā)病情況和體重。

1.7 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析

2 結(jié) 果

2.1 重組穿梭質(zhì)粒和重組腺病毒的構(gòu)建

先構(gòu)建的ORFV重組腺病毒載體pAd-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP，經(jīng)PCR擴增，顯示F1L(1 026 bp)、B2L(1 134 bp)、F1L-T2A-B2L(2 223 bp)基因的大小與預期符合；HindⅢ和XhoⅠ雙酶切后出現(xiàn)35 283和2 203 bp兩條帶，表明ORFV目的基因成功插入腺病毒穿梭載體(圖1)。構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒pAdEasy-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP，經(jīng)PacⅠ酶切鑒定，酶切后有約2和35 kb的片段，與預期大小符合(圖略)。

重組腺病毒質(zhì)粒經(jīng)轉(zhuǎn)染HEK-293細胞，出現(xiàn)病變效應綠色熒光，表明成功獲得重組腺病毒pAV-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP和pAV-CMV-EGFP。

2.2 重組腺病毒MDBK細胞內(nèi)表達與毒力測定

pAV-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP和pAV-CMV-EGFP分別感染MDBK細胞，研究其能否在細胞中表達，結(jié)果轉(zhuǎn)染后72 h觀察到細胞圓縮、病變效應明顯，熒光顯微鏡下細胞內(nèi)可見綠色光團，而對照組MDBK細胞生長良好，無CPE和熒光(圖2)。將純化后的重組腺病毒連續(xù)10倍10個梯度稀釋后，感染MDBK細胞，Karber法進行毒力計算，結(jié)果：pAV-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP的TCID50=1×10-5.375·mL-1；pAV-CMV-EGFP的TCID50=1×10-6.875·mL-1。

M. DL2000相對分子質(zhì)量標準；1. pAd-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP陰性對照；2. pAd-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP F1L基因；3. pAd-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP B2L基因；4. pAd-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP F1L-T2A-B2L基因；M1. DL10000 相對分子質(zhì)量標準；5. HindⅢ單酶切產(chǎn)物；6. XhoⅠ單酶切產(chǎn)物；7. HindⅢ、XhoⅠ雙酶切產(chǎn)物M. DL2000 marker; 1. pAd-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP negative control; 2. pAd-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP F1L gene; 3. pAd-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP B2L gene; 4. pAd-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP F1L-T2A-B2L gene; M1. DL10000 marker; 5. HindⅢ single digestion products; 6. XhoⅠ single digestion products; 7. HindⅢ, XhoⅠ double digestion products圖1 重組腺病毒載體的 PCR鑒定和HindⅢ、XhoⅠ酶切鑒定Fig.1 PCR identification of recombinant adenovirus vector and HindⅢ, XhoⅠ digestion identification

A. 感染前MDBK細胞；B. 感染后72 h的DMBK細胞；C. 感染后熒光下MDBK細胞A. Pre-infected MDBK cells; B. DMBK cells at 72 h after infection; C. MDBK cells after infection under fluorescence圖2 重組腺病毒感染MDBK細胞Fig.2 Recombinant adenovirus infects MDBK cells

2.3 重組腺病毒表達后鑒定

2.3.1 重組腺病毒F1L、B2L基因檢測 以MDBK細胞擴增的重組腺病毒DNA為底物，用F1L上下游引物、B2L上下游引物及F1L上游引物和B2L下游引物分別擴增F1L、B2L、F1L-T2A-B2L基因，結(jié)果見圖3。pAV-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP的DNA中擴增出F1L(1 026 bp)、B2L(1 134 bp)、F1L-T2A-B2L(2 223 bp)，與預期大小一致，而pAV-CMV-EGFP無目的條帶出現(xiàn)。

2.3.2 重組腺病毒間接免疫熒光檢測 結(jié)果見圖4，轉(zhuǎn)染pAV-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP的細胞樣品有紅色熒光，表明與抗體發(fā)生反應，F(xiàn)1L、B2L蛋白有表達，而轉(zhuǎn)染pAV-CMV-EGFP的樣品并無該現(xiàn)象。

M. DL2000相對分子質(zhì)量標準；1. pAV-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP F1L基因；2. pAV-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP B2L基因；3. pAV-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP F1L-T2A-B2L基因；4. pAV-CMV-EGFP F1L基因；5. pAV-CMV-EGFP B2L基因；6. pAV-CMV-EGFP F1L-T2A-B2L基因M. DL2000 marker; 1. pAV-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP F1L gene; 2. pAV-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP B2L gene; 3. pAV-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP F1L-T2A-B2L gene; 4. pAV-CMV-EGFP F1L gene; 5. pAV-CMV-EGFP B2L gene; 6. pAV-CMV-EGFP F1L-T2A-B2L gene圖3 重組腺病毒F1L、B2L基因PCR鑒定Fig.3 PCR amplification for identifying F1L, B2L genes of the recombinant adenovirus

A. 轉(zhuǎn)染pAV-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP；B. 轉(zhuǎn)染pAV-CMV-EGFPA. Transfection of pAV-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP; B. Transfection of pAV-CMV-EGFP圖4 IFA間接免疫熒光檢測Fig.4 IFA indirect immunofluorescence assay

2.4 重組腺病毒免疫效果評價

2.4.1 小鼠IgG酶聯(lián)免疫分析 IgG酶聯(lián)免疫分析結(jié)果見圖5：pAV-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP免疫組小鼠初免第1周抗體水平明顯升高，且與PBS組差異顯著(P<0.05)，第2、3周抗體水平極顯著高于PBS組(P<0.01)，二免后第4周達到峰值——(134.13±8.01) ng·mL-1，極顯著高于PBS組(P<0.01)，第5周抗體水平開始下降，仍顯著高于PBS組(P<0.05)；PBS組小鼠抗體水平穩(wěn)定無明顯波動。

與PBS組比較, **.P<0.01, *.P<0.05，下同Compared with PBS group, **.P<0.01, *.P<0.05. The same as below圖5 小鼠血清IgG含量測定Fig.5 Determination of serum IgG in mice

2.4.2 小鼠T淋巴細胞增殖結(jié)果 小鼠脾淋巴細胞經(jīng)非特異性刺激(ConA)、特異性刺激(滅活ORFV)和無刺激(RPMI-1640)處理后，淋巴細胞增殖情況如圖6所示。ConA刺激后，ORFV重組腺病毒組OD值高于PBS組，但兩者之間均無顯著差異(P>0.05)；ORFV重組腺病毒組對特異性抗原ORFV表現(xiàn)出明顯的T淋巴細胞增殖能力，其OD值極顯著高于PBS組(P<0.01)；無刺激組顯示，ORFV重組腺病毒組OD值極顯著高于PBS組(P<0.01)。ORFV重組腺病毒組在3種處理下脾淋巴細胞均出現(xiàn)增殖現(xiàn)象。

1. pAV-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP; 2. PBS圖6 小鼠脾淋巴細胞增殖試驗Fig.6 Spleen lymphocyte proliferation test in mice

2.4.3 小鼠攻毒保護效力 小鼠攻毒后第9～11天，PBS和pAV-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP兩組剩余的8只小鼠中分別有4只(50%)、1只(12.5%)小鼠出現(xiàn)精神沉郁、弓背，攻毒部位可見皮毛松亂，有啃咬現(xiàn)象。攻毒后6～8周內(nèi)PBS組小鼠體重明顯降低，整體采食量減少； pAV-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP組小鼠體重逐漸增加，接近空白對照組；而未攻毒組小鼠體重值趨于穩(wěn)定，說明ORFV重組腺病毒呈現(xiàn)一定的保護效果，見圖7。

3 討 論

羊口瘡作為一種病毒性傳染病已呈現(xiàn)全球性暴發(fā)，毒株的類型日新月異，易感物種日益擴增，活病毒逃逸且尚無特效藥物治愈，這些現(xiàn)象致使病程持續(xù)蔓延，嚴重牽制著世界各地養(yǎng)羊業(yè)規(guī)?；难杆倭己冒l(fā)展。腺病毒基因表達載體其基因組能夠承載多種異源基因，對靜止和分裂期細胞均可轉(zhuǎn)染，目前廣泛用于基因疫苗的研究[9]，在人和動物的腺病毒載體構(gòu)建及臨床應用上均有成功的案例[10-13]。ORFV的F1L和B2L基因是兩個重要的保護性抗原基因，其中F1L蛋白可介導細胞免疫，引起機體產(chǎn)生免疫反應，被認為是羊口瘡亞單位疫苗研制的標準抗原[14]；B2L蛋白則可刺激機體產(chǎn)生抗體反應，促使淋巴細胞增殖[15]。盡管ORFV以細胞免疫為主，而體液免疫水平相對較低，但因該兩種蛋白具有較好的免疫原性，本研究將F1L、B2L兩基因串聯(lián)，構(gòu)建ORFV雙基因重組腺病毒載體，以期對動物機體產(chǎn)生更好的免疫保護作用。

本研究成功包裝出ORFV重組腺病毒，可根據(jù)綠色熒光蛋白基因在轉(zhuǎn)染細胞中是否產(chǎn)生綠色熒光進行鑒定篩選。獲得pAV-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP重組腺病毒并感染MDBK細胞，經(jīng)PCR、IFA檢測，結(jié)果表明，該重組腺病毒能夠穩(wěn)定攜帶F1L、B2L基因。毒力測定結(jié)果顯示，空載體pAV-CMV-EGFP的滴度(TCID50=1×10-6.875·mL-1)遠高于pAV-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP的滴度(TCID50=1×10-5.375·mL-1)，可能由于羊口瘡病毒重組腺病毒導入的外源基因(F1L、B2L、T2A、P2A)較多，進而對腺病毒的繁殖速度有所影響。這與楊玉艾等[16]研究的豬瘟病毒E0、E2基因構(gòu)建的重組腺病毒rAd-E0-E2滴度低于其空載體rAd-CMV滴度的結(jié)果相一致。

在免疫策略上研究證明，初次免疫后再次加強免疫方式可全面激發(fā)體液免疫和細胞免疫應答水平[17-18]。本研究采用相同免疫方式免疫ICR小鼠，ORFV重組腺病毒組IgG OD值明顯高于PBS對照組，由此可見ORFV重組腺病毒可快速刺激機體產(chǎn)生抗體，說明所構(gòu)建的羊口瘡病毒重組腺病毒能夠迅速刺激小鼠機體產(chǎn)生體液免疫應答。此外，小鼠脾淋巴細胞增殖試驗結(jié)果顯示，ORFV重組腺病毒免疫小鼠對細胞免疫應答水平也有所促進，它對特異性抗原ORFV和非特異性ConA蛋白抗原的刺激均可誘導T淋巴細胞增殖，但對非特異性抗原刺激表現(xiàn)的增殖能力較強，符合趙魁[19]的試驗結(jié)果，這表明經(jīng)pAV-CMV-F1L-T2A-B2L-P2A-EGFP免疫后，小鼠的免疫系統(tǒng)在一定程度上處于高活化狀態(tài)。

以小鼠攻毒試驗對所構(gòu)建的羊口瘡病毒重組腺病毒進行安全性和效果評價，ORFV重組腺病毒免疫組小鼠體重趨于穩(wěn)定，在ORFV攻毒后體重仍呈上升趨勢，接近于未攻毒組，說明該免疫組并未影響小鼠整體正常采食生長狀況，僅有1只小鼠攻毒后精神狀態(tài)不佳，結(jié)果提示能夠提供一定的安全免疫保護作用。但本研究中，各免疫組小鼠在攻毒部位均未見特征性結(jié)痂病變及死亡情況，這可能與小鼠品系、病原毒性、攻毒劑量等因素相關(guān)。另外，腺病毒大劑量使用通常會引起嚴重的免疫反應[20]，甚至引發(fā)組織損傷[21]，因而免疫方法、免疫劑量、疫苗的種類及抗原蛋白表達水平都有待于進一步優(yōu)化和研究。

4 結(jié) 論

成功構(gòu)建ORFV的F1L、B2L基因串聯(lián)表達的重組腺病毒，免疫小鼠后能夠刺激小鼠產(chǎn)生體液免疫和細胞免疫應答，且未影響小鼠正常采食，保護效力較好。該研究可為ORFV DNA疫苗的研制提供應用和理論依據(jù)。