楊洪偉，張麗穎，紀建偉，王 成，王曉冬，宋 平，宋 鵬

?

低場核磁共振分析聚乙二醇對萌發(fā)期水稻種子水分吸收的影響

楊洪偉1,2,3，張麗穎4，紀建偉1※，王 成2,3，王曉冬2,3，宋 平1，宋 鵬2,3

（1. 沈陽農(nóng)業(yè)大學信息與電氣工程學院，沈陽 110866；2. 國家農(nóng)業(yè)信息化工程技術(shù)研究中心，北京 100097；3. 國家農(nóng)業(yè)智能裝備工程技術(shù)研究中心，北京 100097； 4. 遼寧省水稻研究所，沈陽 110161）

為研究聚乙二醇（PEG，polyethylene glycol）處理下水稻種子萌發(fā)過程中內(nèi)部水分分布和變化規(guī)律，進而揭示水稻耐旱性在水分吸收規(guī)律上的重要特征。應用低場核磁共振的2弛豫譜和質(zhì)子密度加權(quán)成像分析了PEG處理下水稻種子萌發(fā)過程中的水分變化，研究了利用蒸餾水（對照）和質(zhì)量分數(shù)分別為10%、20%PEG6000處理對兩個水稻品種旱9710、遼星1發(fā)芽指標的影響，以及對兩個水稻品種萌發(fā)0、6、22、48、72 h吸水量的影響，確定單位質(zhì)量核磁信號幅值與水稻種子濕基含水率的回歸函數(shù)關(guān)系。發(fā)芽指標檢測結(jié)果顯示：旱9710耐旱性高于遼星1。質(zhì)子密度加權(quán)成像結(jié)果顯示：在水分吸收初期，水分子直接通過種子表面裂縫進入種子體內(nèi)，胚乳中的淀粉粒等物質(zhì)開始吸水膨脹，種子體積增大。24 h后，種子內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)向種胚流動。PEG處理下，水稻種子吸水量明顯減少，發(fā)芽速度明顯降低，且PEG質(zhì)量分數(shù)越高，發(fā)芽速度越慢?；诤舜殴舱窭碚摷?弛豫譜的多組分特征，當反演頻率為10 000時，水稻種子萌發(fā)過程中的水分分為束縛水與自由水兩部分。2弛豫譜結(jié)果表明：在蒸餾水和質(zhì)量分數(shù)分別為10%、20%PEG處理下，種子濕基含水率和核磁信號幅值均逐漸增長。PEG處理下，核磁信號幅值增長相比對照處理顯著降低（<0.05）。PEG處理抑制了兩個水稻品種種子對水分的吸收，PEG質(zhì)量分數(shù)越高，抑制作用越強。PEG處理24 h后，耐旱性強的水稻品種吸水率相比對照處理的降低幅度小于耐旱性弱的品種?；貧w分析表明，3種處理下，核磁信號幅值和濕基含水率具有一致的線性關(guān)系（2=0.983），由回歸方程可以求得水稻種子萌發(fā)過程中各狀態(tài)水分的含量。試驗為研究水稻種子萌發(fā)過程對干旱脅迫的反應機制，開發(fā)種子水分微觀活體無損檢測技術(shù)等方面的研究提供理論支持和數(shù)據(jù)參考。

核磁共振；種子；水分；核磁共振成像；干旱脅迫；萌發(fā)過程

0 引 言

干旱是全球最嚴重的自然災害之一，持續(xù)的干旱逆境會阻礙糧食作物的生長，導致作物大幅減產(chǎn)甚至絕收[1-2]。水稻是全球第二大糧食作物，是全球約50%人口的主糧，但與其他作物相比，水稻的耐旱性較差，更易遭受干旱傷害，所以培育和篩選耐旱性強的旱直播水稻是緩解水資源危機、解決全球糧食問題的主要途徑之一。旱直播水稻種子萌發(fā)期間的吸水量及水分存在狀態(tài)與出苗率乃至最終產(chǎn)量息息相關(guān)，因此，了解水稻種子萌發(fā)過程中水分的遷移規(guī)律是進行抗逆水稻品種培育和篩選的關(guān)鍵，目前水分測定常用的烘干減重等方法均只能測定含水量指標，并且都需要進行破壞性試驗，而且不能反映種子內(nèi)部各相態(tài)水分變化[3-5]。

低場核磁共振是一種有效的非損傷、非侵入的測量技術(shù)，能夠檢測植株及果實內(nèi)部水分含量和分布的變化規(guī)律，在農(nóng)產(chǎn)品檢測等領(lǐng)域具有巨大潛力[6-9]。目前國內(nèi)外學者利用低場核磁共振技術(shù)的研究主要集中在食品儲藏、加工及處理過程中的水分傳遞[10-12]、食品摻假檢測[13-15]、土壤及作物各部位水分分布[16-20]等方面，但利用低場核磁共振技術(shù)檢測模擬干旱脅迫下萌發(fā)期種子水分遷移規(guī)律的研究鮮有報道。

本文以水稻種子為研究對象，以低場核磁共振弛豫譜及成像為技術(shù)手段，分析在蒸餾水和質(zhì)量分數(shù)為10%、20%聚乙二醇-6000（PEG6000）模擬干旱脅迫處理下，水稻種子萌發(fā)0、6、24、48、72 h過程中的內(nèi)部水分分布及流動規(guī)律，由此分析在干旱脅迫下水稻種子萌發(fā)過程中的水分吸收及遷移規(guī)律，為抗旱水稻種子培育和篩選等方面的研究提供無損檢測方法和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設(shè)備

考慮到不同水稻品種對核磁信號的影響，試驗中選用耐旱性較強的旱9710和較弱的遼星1水稻種子為試驗材料，種子年份2016年，由遼寧省水稻研究所提供。MiNiMR-60核磁共振儀（上海紐邁電子科技有限公司）；HPG-280BX光照培養(yǎng)箱（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）；電熱鼓風干燥箱GZX-9023MBE(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；XS105DU型微量電子天平(瑞士梅特勒托利多科學儀器有限公司)；玻璃培養(yǎng)皿。

化學試劑：PEG6000；NaClO；蒸餾水。

1.2 研究方法

1.2.1 樣品制備及處理

試驗于2017年8月－2018年1月在國家農(nóng)業(yè)信息化工程技術(shù)研究中心微生理實驗室及種子品質(zhì)檢測實驗室進行，挑選籽粒均勻、飽滿的旱9710（H9710）、遼星1（LX1）水稻種子各3 600粒，每組20粒，共180組，30組用于測定核磁信號，150組用于測定不同時期干質(zhì)量。另取2個品種水稻種子各180粒，每組30粒，共6組，用于核磁共振成像試驗，每次對5粒種子一起成像，每處理2個重復，共得到30幅質(zhì)子密度加權(quán)圖像。

本試驗之前進行了預試驗，設(shè)置質(zhì)量分數(shù)分別為0、5%、10%、20%、30% 5個PEG濃度[21]，通過發(fā)芽試驗發(fā)現(xiàn)，5%PEG濃度與對照對比不明顯，30% PEG濃度導致絕大多數(shù)種子不發(fā)芽，因而選擇對比明顯的0、10%、20%PEG濃度。水稻種子萌發(fā)前6 h一般為物理吸脹吸水階段，6～24 h為遲緩吸水階段，24～48 h為生長吸水階段[22-23]。因試驗中加入了PEG處理，發(fā)芽速度變慢，因而試驗時間延長到72 h。

每次試驗前，先用3%NaClO溶液浸泡種子3～5min消毒處理，然后用蒸餾水沖洗3～5次并用吸水紙吸干表面水分，均勻放置于鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，分別用等量的蒸餾水（對照）和質(zhì)量分數(shù)為10%、20%的PEG 6000溶液對種子進行萌發(fā)處理，以浸濕濾紙和種子為宜，將各組樣本置于溫度為（27±1）℃的HPG-280BX光照培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，設(shè)置12 h光照和12 h無光照交替模式，上述對照處理和各質(zhì)量分數(shù)PEG處理均設(shè)置10個重復，在第0、6、22、48、72 h測定種子干質(zhì)量、鮮質(zhì)量及核磁波譜信號、核磁成像。

另取2個品種水稻種子各1 000粒，每品種分為10組，每組100粒，用于發(fā)芽指標檢測。

發(fā)芽率=最終發(fā)芽種子數(shù)/供試發(fā)芽總數(shù)×100% （1）

發(fā)芽勢=第4天時全部發(fā)芽種子數(shù)/

供試發(fā)芽總數(shù)×100% （2）

發(fā)芽指數(shù)=ΣG/D（3）

平均發(fā)芽時間=Σ(G×D)/最終發(fā)芽總數(shù) （4）

式中G為第天發(fā)芽種子數(shù),D為相應的發(fā)芽天數(shù)。

1.2.2 橫向弛豫時間2反演譜及質(zhì)子密度加權(quán)圖像采集

試驗中核磁共振技術(shù)主要包含核磁共振弛豫譜分析和核磁共振成像兩部分，核磁共振弛豫譜分析主要通過橫向弛豫時間2反演譜反映水分子的流動性，核磁共振成像主要通過質(zhì)子密度加權(quán)圖像直觀顯示被測樣品的物理、化學及生物反應情況。

試驗前，首先將標準油樣放入直徑為12 mm試管中并置于磁體箱的中心位置，利用FID序列標定中心頻率及90°、180°脈寬。然后把油樣取出，將待測種子放入該試管中并置于永磁體的中心位置，利用CPMG序列檢測水稻種子的核磁信號，每樣品重復5次，將每次采集到的核磁信號除以樣品的鮮質(zhì)量，得到單位質(zhì)量樣品的核磁信號，取平均值后導入反演軟件T2_InvfitGeneral Ver 4.09，通過反演運算得到單位質(zhì)量種子樣品2反演譜。

核磁成像檢測采用SE（spin echo）序列進行質(zhì)子密度加權(quán)成像，采集樣本冠狀面（coronal）圖像，獲取水稻種子縱向剖面信息。

1.2.3 種子鮮質(zhì)量、干質(zhì)量的測定

將分別萌發(fā)至0、6、24、48、72 h的不同處理水稻種子從培養(yǎng)皿中取出，用蒸餾水沖洗3～5次并用吸水紙吸干表面水分后用XS105DU天平稱量每組質(zhì)量取平均值作為該樣本鮮質(zhì)量，稱量后放入干燥箱中，105 ℃殺青30 min后，80 ℃烘干至恒質(zhì)量，稱量每組質(zhì)量取平均值作為該樣本干質(zhì)量。

1.2.4 不同處理下水稻種子濕基含水率核磁共振檢測方法的建立

由核磁共振原理可知，橫向弛豫時間2反演譜各個峰峰面積總和與被測樣品中氫質(zhì)子的數(shù)量成正比，而氫質(zhì)子主要來自于水分子，因此可以用峰面積總和代表水稻種子中的含水率。利用以上1.2.2和1.2.3節(jié)檢測的核磁信號幅值及水稻種子鮮質(zhì)量f、干質(zhì)量d，可以求出種子的濕基含水率MC（%），計算公式為

MC=(f?d)/f×100% （5）

將每個樣品的核磁信號幅值除以該樣品的鮮質(zhì)量得到單位質(zhì)量樣品的核磁信號幅值，由此可以通過回歸分析，確定單位質(zhì)量種子濕基含水率與核磁共振信號幅值的一元線性回歸方程，并通過2對回歸方程的顯著性進行檢驗。

1.3 數(shù)據(jù)處理

將核磁共振采集的質(zhì)子密度加權(quán)圖像用紐邁核磁共振圖像處理軟件進行統(tǒng)一灰度、濾波、偽彩。將2反演譜數(shù)據(jù)用統(tǒng)計分析軟件SPSS19.0進行回歸分析和方差分析，<0.05為顯著水平，<0.01為極顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同質(zhì)量分數(shù)PEG處理對水稻種子發(fā)芽指標的影響

PEG處理對水稻種子的發(fā)芽指標影響顯著，如表1中數(shù)據(jù)所示，相比對照處理，旱9710在10% PEG處理下，平均發(fā)芽時間延長了0.75 d、發(fā)芽指數(shù)降低了18.50%。20% PEG處理下，平均發(fā)芽時間延長了1.7 d，發(fā)芽指數(shù)降低了39.15%。遼星1在10% PEG處理下，平均發(fā)芽時間延長了0.7 d、發(fā)芽指數(shù)降低了30%，20% PEG處理下，平均發(fā)芽時間延長了2.8 d，發(fā)芽指數(shù)降低了60.28%。

相比對照處理，PEG處理明顯延遲了2個水稻品種發(fā)芽時間，降低了2個水稻品種發(fā)芽指數(shù)，且對遼星1的抑制作用顯著高于旱9710（<0.01）?？梢?，PEG處理抑制了種子的萌發(fā)過程，且20%PEG處理抑制作用高于10%PEG處理。品種間對比，旱9710發(fā)芽指數(shù)降低幅度明顯低于遼星1，可以推斷旱9710耐旱性高于遼星1。

表1 不同處理下水稻種子發(fā)芽特性變化Table 1 Changes of germination attributes of rice seeds under different solutions

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標準差，同列數(shù)值后小寫字母分別表示不同處理下差異達到顯著水平（<0.05），大寫字母表示差異達到極顯著水平（<0.01）。

Note: Values are means ± standard error. Values followed by small letters in the same column are significantly different (<0.05) at different solutions, values followed by capital letters in the same column are highly significantly different (<0.01).

2.2 PEG處理下水稻種子萌發(fā)過程核磁共振成像分析

水稻種子萌發(fā)過程核磁共振成像主要通過質(zhì)子密度加權(quán)圖像來反映種子內(nèi)部氫質(zhì)子的分布，水稻種子的核磁共振信號主要來源于氫質(zhì)子，氫質(zhì)子密度越大的區(qū)域，從圖像中可以看到該區(qū)域會變得越明亮，由此可以通過質(zhì)子密度加權(quán)像圖像的亮度值變化，來反映水稻種子萌發(fā)過程中氫質(zhì)子變化進而推斷含水率變化及水分分布情況。

利用MiNiMR-60核磁共振成像系統(tǒng)，重復時間設(shè)置為240 s，每次成像約用時70 min，因成像時種子從溶液中取出再次放入對吸水率影響很大，下次成像時使用了不同種子，因此得到的圖像種子位置及大小略有差異，為減少種子個體差異對試驗結(jié)果的影響，每次選取5粒種子一起成像，每次成像2個重復。

利用核磁共振成像系統(tǒng)得到的種子成像灰度圖能清楚顯示種子輪廓及從整體反映吸水量大小（如圖1），但不能細致的區(qū)分水分在各部位的分布及流動，因此對灰度圖進行統(tǒng)一映射、濾波、偽彩處理，得到具有更高辨識度的彩色圖像（如圖2），利用灰度圖結(jié)合偽彩圖，能更好的分析PEG處理下水稻種子萌發(fā)過程中水分的吸收情況。

圖1 對照處理下旱9710種子萌發(fā)灰度圖

水稻種子萌發(fā)起始于親水膠體的吸脹吸水，終止于胚根的伸長生長。圖1是對照處理下旱9710水稻種子萌發(fā)過程中0、6、24、48、72 h時成像灰度圖，圖2a是對照處理下成像偽彩圖。初始時，種子腹面基部種胚位置亮度明顯高于其他位置，這是因為種胚中蛋白質(zhì)和脂肪含量較高[22]，因而氫質(zhì)子密度較大。通過灰度圖（圖1）可以看出，6 h后，種子體積逐漸增大，各部位亮度逐漸升高，這可能是由于種子胚乳中的淀粉粒等物質(zhì)開始吸水膨脹，水分增加，酶開始活動，種子代謝活動增強，胚乳中的淀粉粒等營養(yǎng)物質(zhì)被分解成葡萄糖等可溶性物質(zhì)，同時種胚吸收這些被分解的物質(zhì)，形成新的復雜的有機物，構(gòu)成新細胞，使細胞數(shù)目增多，體積增大，48 h后開始“露白”，72 h后開始長出胚根和胚芽。

注：亮度表示樣品中氫質(zhì)子密度大小。

圖2a水稻種子在萌發(fā)6 h后，種胚亮度及面積明顯增大，這是由于水分子通過種子表面裂縫進入種子體內(nèi)，胚乳中的淀粉粒等物質(zhì)開始吸水膨脹，24 h時，整個種子的亮度已基本一致，說明種子已吸水充足，其中2粒種子由于個體差異吸收水分相比其他3粒稍少一些。種子吸足水分后，上皮細胞和糊粉層可以分泌一些酶類，把胚乳中的淀粉、蛋白質(zhì)等分解為可溶性營養(yǎng)物質(zhì)，并將這些營養(yǎng)物質(zhì)吸收轉(zhuǎn)運到正在生長的胚中，種胚體積進一步擴大，胚根開始突破種皮，因而48h時，圖像顯示種胚亮度及面積明顯增加，圖像下部亮度及區(qū)域明顯減小，72 h時，種胚進一步吸收營養(yǎng)物質(zhì)，胚根繼續(xù)生長，胚芽開始長出。

圖2b～c是PEG處理下旱9710水稻種子萌發(fā)過程核磁成像，從圖像可以清楚的看出PEG處理抑制了種子萌發(fā)的速度，前24 h，相比對照處理，種子亮度區(qū)域明顯較小，48、72 h時，水稻種子的發(fā)芽速度明顯低于對照處理，10%PEG處理72 h時才開始“露白”，而20%PEG處理則更為遲緩，這與前人的研究結(jié)果是一致的[24-26]。這可能是PEG處理下，水分供應不足，難以滿足物質(zhì)代謝的需求，酶的活化速度以及養(yǎng)料的分解和轉(zhuǎn)運速度降低，使種子萌發(fā)受到抑制或發(fā)芽延遲。

2.3 PEG處理下核磁信號幅值與不同相態(tài)水分關(guān)系的建立

種子的萌發(fā)過程與種子含水率及存在狀態(tài)密切相關(guān)，種子中的水分一般分為束縛水和自由水2種狀態(tài)。干燥水稻種子的水分絕大部分以束縛水形式存在，細胞原生質(zhì)呈凝膠狀態(tài)，只進行微弱的物質(zhì)轉(zhuǎn)化和呼吸作用。種子吸水后，促使原生質(zhì)由凝膠狀態(tài)向溶膠狀態(tài)轉(zhuǎn)變，為酶和可溶性物質(zhì)提供了溶劑，物質(zhì)轉(zhuǎn)化效率提高。同時種子吸水后種皮變軟，膜透性增強，使氧氣容易透入，種子內(nèi)部胚細胞呼吸加劇，進而加快了胚乳中的淀粉、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)的分解和轉(zhuǎn)運，使胚細胞不斷生長、分裂，突破種皮，逐漸生長出胚芽和胚根[22-23]。

圖3 不同處理下單位質(zhì)量旱9710水稻種子T2反演譜

由核磁共振原理可知，橫向弛豫時間2與氫質(zhì)子的種類和體系所處的理化狀態(tài)有著緊密的關(guān)系，樣品本身的性質(zhì)決定了弛豫時間，因此通過分析樣品的橫向弛豫時間就可以分析研究樣品中水分子與其他物質(zhì)的結(jié)合緊密程度。不同的2弛豫時間代表不同相態(tài)的水分，依據(jù)相態(tài)的不同，將2弛豫時間分為短弛豫時間21和長弛豫時間22，21代表的水分稱為束縛水，22代表的水分稱為自由水，對應的核磁信號幅值稱為21和22。圖3為反演頻率為10 000時，對照處理和質(zhì)量分數(shù)為10%、20%PEG處理下旱9710水稻種子經(jīng)過0、6、24、48、72 h萌發(fā)時間的2反演譜，2反演譜橫坐標表示橫向弛豫時間2，2值越大，代表水分子與其他物質(zhì)結(jié)合的越疏松，縱坐標代表單位質(zhì)量樣品核磁信號強度，信號越強代表氫質(zhì)子數(shù)量越多，含水量越大，從圖3a～3c可以看出，對照處理和PEG處理下2反演譜均呈現(xiàn)出兩個峰，由以上分析可知，0～10 ms的大峰代表束縛水信號幅值，10～100 ms的小峰代表自由水信號幅值。隨著萌發(fā)時間的延長，3種處理下，兩個峰面積均逐漸增加，表明3種處理下，水稻種子吸水量均不斷增加。PEG處理下，兩個峰面積增加幅度均小于對照處理，且20%PEG處理下峰面積增加幅度小于10%PEG處理，表明PEG處理限制了水稻種子對水分的吸收，PEG質(zhì)量分數(shù)越大，限制作用越大。

2.4 PEG處理對不同相態(tài)水分核磁信號幅值的影響

通過表2數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，PEG處理對2個水稻品種萌發(fā)過程中核磁信號幅值影響顯著（<0.05）。PEG處理下，隨著萌發(fā)時間延長，核磁信號幅值逐漸增加，但相比對照處理，萌發(fā)相同時間后，束縛水增加幅度降低，且PEG質(zhì)量分數(shù)越高，降低幅度越大，自由水則呈現(xiàn)不規(guī)律的振蕩趨勢。以旱9710為例，相比初始，對照處理6、24、48、72 h后，核磁信號幅值（束縛水和自由水信號幅值之和）分別增加了196.19%、248.59%、273.42%、289.66%，6、24 h時吸水急劇增加，24 h后吸水幅度變慢，這是因為前24 h屬于種子萌發(fā)的物理吸脹階段，依靠原生質(zhì)的吸脹作用快速吸水，24 h后屬于種胚萌動階段，在這一階段，種子內(nèi)生物化學活動開始活躍，呼吸作用增強，需水量減少。相比初始，10%PEG處理6、24、48、72 h后，核磁信號幅值分別增加了172.38%、227.59%、254.32%、278.85%。相比初始，20%PEG處理6、24、48、72 h后，核磁信號幅值分別增加了158.44%、211.02%、240.31%、255.43%。從圖1也可以看出，對照處理和PEG處理下，隨著萌發(fā)時間的延長，各個峰對應的面積均逐漸增加，但PEG處理下增加幅度小于對照處理，可見，PEG處理下，水稻種子吸水量減少。這與核磁成像顯示的結(jié)果是一致的。這可能是PEG處理下，溶液中滲透勢增強，水勢降低，進入種子內(nèi)的自由水降低引起酶和可溶性物質(zhì)活動減弱，蛋白質(zhì)和糖類等營養(yǎng)物質(zhì)積累減少，這些物質(zhì)中的親水基吸附自由水分子成為結(jié)合水的能力減弱，同時毛細管的面積減少也使吸附的束縛水含量減少，PEG質(zhì)量分數(shù)越高滲透勢越強，水勢越低，代謝活動越緩慢，需水量越少[27-29]。

表2 不同質(zhì)量分數(shù)PEG處理下單位質(zhì)量旱9710、遼星1水稻品種束縛水、自由水信號幅值變化Table 2 Change of bound water signal amplitude and free water signal amplitude under different mass fraction PEG solution of per unit mass H9710 and LX1 rice varieties

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標準差，同行數(shù)值后小寫字母分別表示不同處理下21或22差異達到顯著水平（<0.05），大寫字母表示差異達到極顯著水平（<0.01）。

Note: Values are means ± standard error. Values followed by small letters in the same row stand for that21or22are significantly different (<0.05) respectively at different solutions, values followed by capital letters in the same row are highly significantly different (<0.01).

2.5 不同質(zhì)量分數(shù)PEG處理下種子吸水率與耐旱性的關(guān)系

不同水稻品種耐旱性與吸水率密切相關(guān)。設(shè)Δ1為種子萌發(fā)相同時間后，單位質(zhì)量核磁信號幅值相比初始狀態(tài)的增長率，即種子的吸水率。以萌發(fā)6 h為例，則Δ1(6 h)表示如下：

Δ1(6 h)=((6 h)?(初始))/(初始)×100% （6）

其中為初始或萌發(fā)一定時間后核磁信號幅值（束縛水和自由水信號幅值之和）。

由公式（6）可以計算出，種子萌發(fā)6、24、48、72 h后，旱9710在10%PEG處理下吸水率Δ1相比對照處理下吸水率Δ1分別降低了23.81%、21.00%、19.10%、10.82%，在20%PEG處理下分別降低了37.74%、37.58%、33.11%、34.24%。遼星1在10%PEG處理下分別降低了15.45%、21.50%、33.86%、29.48%，在20%PEG處理下分別降低了15.38%、44.46%、63.30%、61.62%。由圖4兩個水稻品種種間對比發(fā)現(xiàn)，PEG處理下，前24 h，同一時間兩個水稻品種吸水率相比對照處理的降低幅度呈現(xiàn)不規(guī)律的波動，24 h后，同一時間相同質(zhì)量分數(shù)PEG處理下，旱9710水稻種子吸水率相比對照處理的降低幅度均小于遼星1。從2.1節(jié)不同質(zhì)量分數(shù)PEG處理對水稻種子發(fā)芽指標的影響可知，旱9710耐旱性高于遼星1。因此由以上分析可以推斷，PEG處理抑制了兩個水稻品種種子對水分的吸收，PEG質(zhì)量分數(shù)越高，抑制作用越強。PEG處理24 h后，耐旱性強的水稻品種吸水率相比對照處理的降低幅度小于耐旱性弱的品種。

圖4 單位質(zhì)量旱9710、遼星1水稻種子吸水率相比對照處理降低幅度對比

2.6 PEG處理下單位質(zhì)量樣品核磁信號幅值與種子濕基含水率的關(guān)系

因為核磁信號幅值與樣品中氫質(zhì)子的數(shù)量成正比，所以可用其表示樣品中的相對總水含量，通過單位質(zhì)量樣品核磁信號幅值與種子濕基含水率的線性回歸曲線，可以定量得到萌發(fā)期水稻種子總水分和不同相態(tài)的水分含量。因此，通過分析核磁共振2反演譜可以間接反映出種子萌發(fā)過程水分的分布及遷移規(guī)律。

2個水稻品種旱9710、遼星1在質(zhì)量分數(shù)為10%、20%PEG處理6、22、48、72 h后，分別相比同期對照處理，水稻種子的濕基含水率依次降低，核磁信號總幅值也依次降低。利用SPSS19.0軟件進行回歸分析，3種處理下，單位質(zhì)量樣品核磁信號幅值和濕基含水率具有較為一致的線性關(guān)系[30]（如圖5），回歸方程為=287.69+728.8（2=0.983），對回歸方程進行顯著性檢驗，=7 230.24，<0.05，達到顯著水平，根據(jù)回歸方程去計算水稻種子萌發(fā)過程中各狀態(tài)水分的含量是可信的。

圖5 單位質(zhì)量種子樣品核磁信號幅值與濕基含水率回歸分析

3 結(jié) 論

1）對2個水稻品種旱9710、遼星1進行對照處理（蒸餾水）和PEG 6000（質(zhì)量分數(shù)為10%、20%）處理72 h發(fā)芽試驗，相比對照處理，PEG處理明顯延遲了2個水稻品種發(fā)芽時間，降低了2個水稻品種發(fā)芽指數(shù)，且對遼星1的抑制作用顯著高于旱9710（<0.01）。可見，PEG處理抑制了種子的萌發(fā)過程，且20%PEG處理抑制作用高于10%PEG處理。兩個品種間對比，旱9710發(fā)芽指數(shù)相比對照處理的降低幅度明顯低于遼星1，可以推斷旱9710耐旱性高于遼星1。

2）核磁共振質(zhì)子密度加權(quán)像顯示，水稻種子萌發(fā)過程中水分吸收初期，水分子直接通過種子表面裂縫進入種子體內(nèi)，胚乳中的淀粉粒等物質(zhì)開始吸水膨脹，種子含水量逐步增加，種子體積逐漸增大，24 h后，種子內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)向種胚流動，為胚根和胚芽生長提供充足營養(yǎng)。這與利用2弛豫譜檢測的結(jié)果是一致的。利用核磁共振成像系統(tǒng)得到的灰度圖結(jié)合偽彩圖，能直觀的顯示水稻種子萌發(fā)過程中水分的吸收和流動規(guī)律。

3）在質(zhì)量分數(shù)為10%、20%的PEG6000處理下，2個水稻品種旱9710、遼星1水稻種子萌發(fā)過程中核磁信號幅值逐漸增加，分別相比對照處理，束縛水信號幅值及自由水、束縛水信號幅值之和明顯降低（<0.05），PEG質(zhì)量分數(shù)度高，降低幅度越大。PEG處理抑制了2個水稻品種種子對水分的吸收，PEG質(zhì)量分數(shù)越高，抑制作用越強。PEG處理24 h后，耐旱性強的水稻品種吸水率相比對照處理的降低幅度小于耐旱性弱的品種。

4）通過回歸分析，對照處理和質(zhì)量分數(shù)為10%、20%的PEG6000處理下，種子萌發(fā)過程中濕基含水率和核磁共振2弛豫譜總幅值存在一致的線性關(guān)系（2=0.983），對回歸方程進行顯著性檢驗，=7 230.24，<0.05，達到顯著水平，通過回歸方程可以求得水稻種子萌發(fā)過程中各狀態(tài)水分的含量。

[1] Chen Q, Tao S, Bi X, et al. Research progress in physiological and molecular biology mechanism of drought resistance in rice[J]. American Journal of Molecular Biology, 2013, 3(2): 102－107.

[2] Zhu Y J, Lei L, Jia Z Q. Research advances on drought resistance mechanism of plant species in arid zones of China[J]. Sciences in Cold and Arid Regions, 2011, 3(5): 448－454.

[3] Naor A, Birger R, Peres M, et al. The effect of irrigation level in the kernel dry matter accumulation period on almond yield, kernel dry weight, fruit count, and canopy size[J]. Irrigation Science, 2018, 36(1): 1－8.

[4] Ross M E, Stanley M S, Day J G, et al. A comparison of methods for the non-destructive fresh weight determination of filamentous algae for growth rate analysis and dry weight estimation[J]. Journal of Applied Phycology, 2017, 29(6): 2925－2936.

[5] Terrile I I, Miralles D J, González F G. Fruiting efficiency in wheat (L): Trait response to different growing conditions and its relation to spike dry weight at anthesis and grain weight at harvest[J]. Field Crops Research, 2017,201: 86－96.

[6] Wang S, Xiang W, Fan H, et al. Study on the mobility of water and its correlation with the spoilage process of salmon (Salmo solar) stored at 0 and 4 °C by low-field nuclear magnetic resonance (LF NMR 1H)[J]. Journal of Food Science & Technology, 2018, 55(1): 173－182.

[7] Meng W, Xu X, Cheng K K, et al. Geographical origin discrimination of oolong tea (TieGuanYin,, (L.) O. Kuntze) using proton nuclear magnetic resonance spectroscopy and near-infrared spectroscopy[J]. Food Analytical Methods, 2017, 10(11): 3508－3522.

[8] Kim H, Padmakshan D, Li Y, et al. Characterization and elimination of undesirable protein residues in plant cell wall materials for enhancing lignin analysis by solution-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy[J]. Biomacromolecules, 2017, 18(12): 4184－4195.

[9] Tan Z, Reyes-Suarez E, Indrasena W, et al. Novel approach to study fish oil oxidation using1H nuclear magnetic resonance spectroscopy[J]. Journal of Functional Foods, 2017,36: 310－316.

[10] Szeleszczuk L, Pisklak D M, Wawer I. Analysis of water in the chicken eggshell using the1H magic angle apinning Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy[J]. Brazilian Journal of Poultry Science, 2016, 18(2): 27－32.

[11] 王淼，張晶，賀妍，等. 基于低場核磁共振的柑橘汁胞?；u級[J]. 農(nóng)業(yè)工程學報，2016，32(7)：290－295.

Wang Miao, Zhang Jing, He Yan, et al. Evaluation of juicy sac granulation in citrus with low field nuclear magnetic resonance[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering(Transactions of the CSAE), 2016, 32(7): 290－295. (in Chinese with English abstract)

[12] 徐建國，徐剛，張緒坤，等. 利用核磁共振成像技術(shù)分析胡蘿卜干燥過程中內(nèi)部水分傳遞[J]. 農(nóng)業(yè)工程學報，2013，29(12)：271－276.

Xu Jianguo, Xu Gang, Zhang Xukun, et al. Moisture transport in carrot during hot air drying using magnetic resonance imaging[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering(Transactions of the CSAE), 2013, 29(12): 271－276. (in Chinese with English abstract)

[13] Santos P M, Pereira-Filho E R, Colnago L A. Detection and quantification of milk adulteration using time domain nuclear magnetic resonance (TD-NMR)[J]. Microchemical Journal, 2016,124: 15－19.

[14] Ribeiro R D O R, Mársico E T, Carneiro C D S, et al. Detection of honey adulteration of high fructose corn syrup by Low Field Nuclear Magnetic Resonance (LF1H NMR)[J]. Journal of Food Engineering, 2014,135: 39－43.

[15] ?mejkalová, D, Piccolo A. High-power gradient diffusion NMR spectroscopy for the rapid assessment of extra-virgin olive oil adulteration[J]. Food Chemistry, 2010, 118(1): 153－158.

[16] Fortiermcgill B, Dutta M R, Lam L, et al. Comprehensive multiphase (CMP) NMR monitoring of the structural changes and molecular flux within a growing seed[J]. J Agric Food Chem, 2017, 65(32): 6779－6788.

[17] 牟紅梅，何建強，邢建軍，等. 小麥灌漿過程籽粒水分變化的核磁共振檢測[J]. 農(nóng)業(yè)工程學報，2016，32(8)：98－104.

Mou Hongmei, He Jianqiang, Xing Jianjun, et al. Water changes in wheat spike during grain filling stage investigated by nuclear magnetic resonance[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2016, 32(8): 98－104. (in Chinese with English abstract)

[18] 孔超，王美艷，史學正，等. 低場核磁探測水稻田改蔬菜地土壤水分的相態(tài)變化[J]. 農(nóng)業(yè)工程學報，2016，32(24)：124－128.

Kong Chao, Wang Meiyan, Shi Xuezheng, et al. Phase change of soil water of vegetable field transformed from paddy field by low field nuclear magnetic resonance[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2016, 32(24): 124－128. (in Chinese with English abstract)

[19] 要世瑾，牟紅梅，杜光源，等. 小麥種子吸脹萌發(fā)過程的核磁共振檢測研究[J]. 農(nóng)業(yè)機械學報，2015，46(11)：266－274.

Yao Shijin, Mou Hongmei, Du Guangyuan, et al. Water imbibition and germination of wheat seed with nuclear magnetic resonance[J]. Transactions of the Chinese Society for Agricultural Machinery, 2015, 46(11): 266－274. (in Chinese with English abstract)

[20] 杜光源，唐燕，張嵩午，等. 小麥葉片衰老態(tài)勢核磁共振分析[J]. 農(nóng)業(yè)機械學報，2014，45(4)：264－270.

Du Guangyuan, Tang Yan, Zhang Songwu, et al. Investigating senescence status of wheat leaves by nuclear magnetic resonance[J]. Transactions of the Chinese Society for Agricultural Machinery, 2014, 45(4): 264－270. (in Chinese with English abstract)

[21] 楊旭東, 聶慧, 侯建華,等. PEG模擬干旱脅迫對向日葵種子萌發(fā)的影響[J]. 種子, 2016, 35(5) ：71－75.

Yang Xudong, Nie Yong, Hou Jianhua, et al. Effects of polyethylene glycol(PEG) simulated drought stress on seed germination of sunflower[J]. Seed, 2016, 35(5) : 71－75.(in Chinese with English abstract)

[22] 高榮岐.種子生物學[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2009：30－205.

[23] 顏啟傳.種子檢驗原理和技術(shù)[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001：139－150.

[24] Toumi Mohamed, Barris Selma,Seghiri Mohamed,et al. Effect of several methods of scarification and osmotic stress on seed germination of Robinia pseudoacacia L[J]. Comptes rendus Biologies, 2017, 340(5): 264－270.

[25] Vibhuti, Shahi C, Bargali K, et al. Seed germination and seedling growth parameters of rice (L.) varieties as affected by salt and water stress[J]. Indian Journal of Agricultural Sciences, 2015, 85(1): 102－108.

[26] 劉克彪，姜生秀. 干旱和鈉鹽脅迫對羅布麻種子萌發(fā)的影響[J]. 草業(yè)學報，2016，25(5)：214－221.

Liu Kebiao, Jiang Shengxiu. Responses of Apoceynum venetumseed germination to drought and salt stress[J]. Acta Prataculturae Sinica, 2016, 25(5): 214－221. (in Chinese with English abstract)

[27] 張春慶.種子檢驗學[M]. 北京：高等教育出版社，2006：128－137.

[28] 潘瑞熾.植物生理學[M]. 北京：高等教育出版社，2008：7－14.

[29] Nogueira Narjara W, Torres Salvador B, de Freitas Romulo

M O, et al. ‘Jurema-de-embira’ seed germination under water stress and at different temperatures[J]. Revista Brasileira de Engenharia Agricola e Ambiental, 2017, 21(4): 244－248.

[30] 要世瑾，杜光源，牟紅梅，等. 基于核磁共振技術(shù)檢測小麥植株水分分布和變化規(guī)律[J]. 農(nóng)業(yè)工程學報，2014，30(24)：177－186.

Yao Shijin, Du Guangyuan, Mou Hongmei, et al. Detection of water distribution and dynamics in body of winter wheat based on nuclear magnetic resonance[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2014, 30(24): 177－186. (in Chinese with English abstract)

Analysis on water absorption of rice seeds during germination process under polyethylene glycol solution using low-field nuclear magnetic resonance

Yang Hongwei1,2,3, Zhang Liying4, Ji Jianwei1※, Wang Cheng2,3, Wang Xiaodong2,3, Song Ping1, Song Peng2,3

(1.110866; 2.100097; 3.100097; 4.110161)

Water absorption is one of the major factors limiting rice seeds germination rate.It is very important to study the drought-tolerance mechanism of rice under drought stress, in order to improve the drought-tolerance capacity of rice and thereby increase the yield. In this paper, 2 varieties of rice seeds were placed in 10%, 20% PEG (polyethylene glycol) 6000 solution and control solution respectively, and moisture variation was analyzed with2relaxation spectrum and proton density weighted image of low field nuclear magnetic resonance (NMR) 0, 6, 22, 48, and 72 h later after seed germination. The influence of PEG solution on water absorption was studied, and the regression equation was deduced between relative moisture content and total signal amplitude of nuclear magnetic signal in this paper.The proton density weighted images obtained by the magnetic resonance imaging system can show the absorption and flow patterns of water during the germination of rice seeds directly. The germination test results showed that the drought resistance of H9710 is higher than that of LX1. The proton density weighted image results showed that water molecules enter the seed directly through cracks on the seed surface, and embryo absorbs water molecules and expands downwards firstly. After 24 h, the nutrient in the seeds flows to the seeds embryo to provide adequate nutrition for the growth of the radicle and germ. The seeds absorbed less water and the germination process was inhibited obviously under PEG stress, and the higher the PEG mass fraction, the less the water absorption and the slower the germination process.This is consistent with the results of2relaxation spectrumdetection. Based on the theory of NMR and multicomponent characteristics of2relaxation spectrum, when inversion frequency was 10000 times, the water in rice seeds during germination was categorized into 2 phases, which were short relaxation time standing for bound water and long relaxation time standing for free water. The2relaxation spectrum results suggested that the amplitude of NMR signals of the bound water, that of the free water and the total amplitude all increased gradually. The drought tolerance of rice seeds is closely related to the relative water absorption rate after 24 h, and PEG solution inhibits the absorption of water; the higher the PEG mass fraction, the stronger the inhibition. The relative water absorption rate of rice varieties with stronger drought resistance was higher than that with weaker drought resistance. The change of NMR signals directly reflects the moisture distribution and water absorption of rice seeds during germination. In addition, the moisture content of the seeds and the total amplitude of NMR signals were positively correlated(2=0.983). This indicated that the data obtained by NMR technique were consistent with those obtained by the conventional dry-weight weighing method. Therefore it is a proper method to detect the moisture content in seeds during germination with NMR technique. By this regression equation, the moisture content of each state of water during seed germination can be calculated. These empirical data offer a reference for the study of rice seeds’ response mechanism under drought stress during seed germination and the screening of germplasm resources, and also develop a new nondestructive detecting technology of moisture for plants under stress.

nuclear magnetic resonance; seeds; moisture; magnetic resonance imaging; drought stress; germination process

10.11975/j.issn.1002-6819.2018.17.036

S351.5+1

A

1002-6819(2018)-17-0276-08

2018-04-07

2018-05-27

國家自然科學基金項目（31701318、31601216）、國家重點研發(fā)計劃（2017YFD0701205）和北京市農(nóng)林科學院科技創(chuàng)新能力建設(shè)專項（KJCX20170418）聯(lián)合資助

楊洪偉，博士生，從事農(nóng)業(yè)信息化與精準農(nóng)業(yè)方面的研究。 Email：yhwsyau@163.com

紀建偉，博士，教授，主要從事農(nóng)業(yè)生物環(huán)境控制與智能檢測研究。Email：jianweiji7879@163.com

楊洪偉，張麗穎，紀建偉，王 成，王曉冬，宋 平，宋 鵬. 低場核磁共振分析聚乙二醇對萌發(fā)期水稻種子水分吸收的影響[J]. 農(nóng)業(yè)工程學報，2018，34(17)：276－283. doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2018.17.036 http://www.tcsae.org

Yang Hongwei, Zhang Liying, Ji Jianwei, Wang Cheng, Wang Xiaodong, Song Ping, Song Peng. Analysis on water absorption of rice seeds during germination process under polyethylene glycol solution using low-field nuclear magnetic resonance[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2018, 34(17): 276－283. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2018.17.036 http://www.tcsae.org