馬金柱,劉 明,張信來(lái),布日古德

0 引言

近年來(lái)的研究資料顯示，乳腺癌在我國(guó)女性中的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，且逐年增加，成為嚴(yán)重危害我國(guó)婦女健康的主要惡性腫瘤之一。研究表明，在我國(guó)女性新發(fā)腫瘤中乳腺癌占據(jù)首位，并且增加比例最為顯著[1]。但迄今為止，乳腺癌的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，其發(fā)生發(fā)展有多因素多基因參與[2]，也是環(huán)境與遺傳因素交叉作用的結(jié)果[3-4]，一級(jí)親屬中具有乳腺癌者占全部乳腺癌患者的5%，且在遺傳性乳腺癌患者中，50%以上的乳腺癌易感基因1(Breast cancer susceptibility gene,BRCA1)和乳腺癌易感基因2(Breast cancer susceptibility gene,BRCA2)陽(yáng)性，BRCA1是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，BRCA1在癌組織中呈高表達(dá)，且這種高表達(dá)具有種族差異性，同時(shí)，基因變異多見(jiàn)于BRCA1基因 exon11上[2，5]。本研究對(duì)我院103例乳腺癌患者BRCA1基因 exon11進(jìn)行測(cè)序，擬分析蒙漢族散發(fā)性乳腺癌患者與BRCA1基因exon11基因變異的關(guān)系，為臨床乳腺癌的防治提供一定理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象及病史采集 選取2010年9月至2014年1月，于我院甲狀腺乳腺外科住院診治、經(jīng)過(guò)病理活檢確診為散發(fā)性乳腺癌的女性患者，本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)及知情同意。

1.2 病例納入標(biāo)準(zhǔn) 經(jīng)過(guò)病理組織學(xué)確診為散發(fā)性乳腺癌的患者；排除任何職業(yè)致癌物接觸史；采血前未經(jīng)過(guò)任何抗癌治療。所有的蒙、漢族研究對(duì)象都要求祖孫三代均居住于內(nèi)蒙古地區(qū)、無(wú)異族通婚史、無(wú)血緣關(guān)系且無(wú)乳腺癌家族史。

1.3 研究方法

1.3.1 樣本采集及處理 分別抽取被檢測(cè)者外周靜脈血樣本2 ml，于EDTA2管中抗凝，顛倒混勻，核對(duì)清晰標(biāo)記，在-80 ℃低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 基因組DNA提取 嚴(yán)格按照血液基因組DNA提取試劑盒TIANamp Blood DNA Kit(離心柱-目標(biāo)號(hào)：DP318)操作說(shuō)明書進(jìn)行基因組DNA提取，將提取DNA濃度用Thermo(NANODROP2000)儀器檢測(cè)所提取DNA的濃度。

1.3.3 DNA濃度和純度測(cè)定 使用DU-88紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA的濃度及純度。設(shè)定紫外光波長(zhǎng)，分別測(cè)定230 nm、260 nm、280 nm波長(zhǎng)時(shí)的OD值。將樣品DNA 2 μl用TE緩沖液稀釋100倍后，分別記錄好編號(hào)、稀釋度。DNA樣本的濃度(μg/μl):OD260×稀釋倍數(shù)×50；DNA樣本的純度：OD260/OD280≈1.8(>1.9時(shí)表明有RNA的污染；<1.6時(shí)表明有蛋白質(zhì)、酚等的污染)，計(jì)算各樣本的濃度和純度并作標(biāo)記后，置于-20 ℃的冰箱中備用。按照隨機(jī)原則抽取部分樣本的DNA 4 μl，用2%瓊脂糖凝膠電泳來(lái)進(jìn)一步鑒定樣本DNA有無(wú)降解。

1.4 BRCA1基因 exon11 PCR擴(kuò)增 委托上海生工有限公司合成BRCA1基因 exon11引物，每一對(duì)引物可擴(kuò)增長(zhǎng)度為700 bp，將BRCA1基因 exon11區(qū)域全長(zhǎng)分段擴(kuò)增，嚴(yán)格按照TAKARA PCR Amplification Kit (Code No.：DR011)使用說(shuō)明進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)。

1.5 DNA目的片段的序列測(cè)定及分析 取待測(cè)序樣本以及其上、下游引物各20 μl，干冰保存送至天津生物芯片公司進(jìn)行序列測(cè)定，該公司序列測(cè)定通過(guò)PCR-SSCP和基因測(cè)序技術(shù)方法完成。測(cè)序數(shù)據(jù)分析：將測(cè)序結(jié)果應(yīng)用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的BLAST應(yīng)用程序與數(shù)據(jù)庫(kù)中的BRCA1基因 exon11目的序列進(jìn)行對(duì)比，從而確定是否為新的突變位點(diǎn)，且根據(jù)HUGO推薦的規(guī)則命名。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性分析。對(duì)所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，年齡差異采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料，如民族、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理類型、免疫組化、分級(jí)情況等比較采用卡方檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 最終納入經(jīng)過(guò)病理活檢確診為散發(fā)性乳腺癌的女性患者103例，包括蒙古族42例，漢族61例，年齡為28～77歲，平均年齡(56.27±10.39)歲。依據(jù)WHO標(biāo)準(zhǔn)(2003年)乳腺癌組織分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ期。以上乳腺癌患者中非浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌52例，浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌51例。所有患者中無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者55例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者48例。檢測(cè)雌激素受體(ER)陽(yáng)性者54例，ER陰性者49例。檢測(cè)孕激素受體(PR)陽(yáng)性者51例，陰性者52例。Cer-2基因表達(dá)陰性者53例，表達(dá)陽(yáng)性者50例。所有入組樣本滿足蒙、漢族的年齡分層、病理分級(jí)、免疫組化情況和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，從而保證入組樣本在蒙古族及漢族之間的可比性。見(jiàn)表1。

表1 入組標(biāo)本一般情況均衡性比較(例)

2.2 BRCA1基因外顯子11擴(kuò)增電泳圖 見(jiàn)圖1。

2.3 BRCA1基因exon11突變檢測(cè)結(jié)果 患者BRCA1基因 exon11的測(cè)序結(jié)果顯示，2例漢族患者BRCA1基因致病性突變(2/103，1.94%)，1例為W372X無(wú)義突變，另1例為2073delA移碼突變，且均為發(fā)生在三陰乳腺癌病例中，并且均被收錄于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中，蒙古族患者未發(fā)現(xiàn)BRCA1基因 exon11突變。見(jiàn)圖2、表2。

圖1 BRCA1基因外顯子11擴(kuò)增電泳圖

圖2 BRCA1 2例基因突變

2.4 統(tǒng)計(jì)分析BRCA1基因exon11突變情況 在103例蒙、漢族散發(fā)性乳腺癌患者BRCA1基因exon11上共發(fā)現(xiàn)突變2例(1例為W372X無(wú)義突變，另1例為2073delA移碼突變)，該2例均發(fā)生在漢族患者，乳腺癌BRCA1基因蒙、漢族突變率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.614)；兩組患者病理類型中乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌占多數(shù)(P=0.750)；兩組間病理組織分級(jí)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；BRCA1突變?nèi)橄侔┗颊叩呐R床分期早于未突變組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.781)。

3 討論

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，患乳腺癌的高危人群已經(jīng)成為不容忽視的群體，而針對(duì)這些特殊群體進(jìn)行靶向化學(xué)預(yù)防已經(jīng)迫在眉睫。盡管在乳腺癌的診斷、治療及預(yù)防等方面已經(jīng)取得進(jìn)步，但仍面臨著巨大挑戰(zhàn)。自1994年，Miki等[6]克隆BRCA1序列后，國(guó)內(nèi)外學(xué)者們研究發(fā)現(xiàn)，該基因與乳腺癌密切關(guān)聯(lián)，攜帶該基因突變患者發(fā)生乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)顯著增高，尤其多見(jiàn)于早發(fā)性乳腺癌及家族性乳腺癌患者[7]。BRCA1基因位于人類17號(hào)常染色體長(zhǎng)臂2區(qū)1帶(17q21)，含有外顯子24個(gè)，長(zhǎng)度為117 kb。BRCA1的基因突變多集中于2、11、20等外顯子上[8-9]。在不同種族、不同人群間的乳腺癌的發(fā)病率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究表明，散發(fā)性乳腺癌患者中，30%左右的患者BRCA1基因的mRNA呈低表達(dá)；進(jìn)一步的研究指出，女性BRCA1基因的胚系突變?nèi)橄侔┲?，超過(guò)80%不表達(dá)孕激素受體(Progestrone receptor,PR)、雌激素受體(Estrogen receptor,ER)和Her-2。這種PR、ER及Her-2均為陰性或缺少的乳腺癌稱為三陰性乳腺癌(Triple negative breast cancer,TNBC)，由于缺乏靶點(diǎn)治療，其治療面臨著更大挑戰(zhàn)[10-11]。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)，BRCA1基因的表達(dá)異常與TNBC有著密切聯(lián)系。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在103例蒙、漢族散發(fā)性乳腺癌患者BRCA1基因exon11中，有2例檢測(cè)出突變，1例為W372X無(wú)義突變，另1例為2073delA移碼突變，并且通過(guò)病理活檢確診上述2例為TNBC。TNBC的發(fā)生與BRCA1基因的突變及功能缺失而導(dǎo)致的同源重組介導(dǎo)的DNA雙鏈斷裂修復(fù)功能受損有關(guān)。Tun 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，約22%的TNBC患者存在BRCA1突變，BRCA1的突變率在TNBC患者中約為非TNBC患者的5.6倍。Loke等[12]研究表明，BRCA1突變是通過(guò)改變蛋白結(jié)合位點(diǎn)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的BRCA1表達(dá)量的變化。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，TNBC的發(fā)生、發(fā)展與BRCA1甲基化聯(lián)系密切，BRCA1啟動(dòng)子甲基化可導(dǎo)致BRCA1表達(dá)水平減少[13]。因此，猜測(cè)本實(shí)驗(yàn)基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)的BRCA1突變可能參與了TNBC的發(fā)生、臨床分期和發(fā)展。

表2 BRCA1基因第11外顯子突變檢測(cè)結(jié)果

在一些特定的群體中，因生態(tài)學(xué)原因?qū)е碌哪撤N類型基因的突變頻率極高，這種效應(yīng)稱為“始祖效應(yīng)”(Founder effect)。近年研究指出,散發(fā)性乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)與基因突變及基因的多態(tài)性等呈相關(guān)性，因地域、人群的不同而呈差異性分布。BRCA1突變率在不同人群中也呈現(xiàn)很大差異。Dillenburg等[14]報(bào)道，在歐洲的一些猶太人群體中BRCA1基因突變較高，尤以5382ins和C185delAG突變較為常見(jiàn)。檢測(cè)西方人群中BRCA1突變陽(yáng)性乳腺癌患者的ER和PR，發(fā)現(xiàn)陰性率高。李鴻濤等[15]研究顯示，在維吾爾族女性乳腺癌患者所切除的癌組織活檢中，BRCA1基因的失表達(dá)率達(dá)37.9%，且維吾爾族女性BRCA1的表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于漢族。本研究結(jié)果顯示，發(fā)生基因突變的2例患者均為漢族，但統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，乳腺癌BRCA1基因蒙、漢族突變率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.614)；內(nèi)蒙古地區(qū)TNBC BRCA1基因exon11的突變率差異無(wú)種族差異性。該結(jié)果可能受位點(diǎn)選擇不同、樣本量少、種族差異、地域差異及蒙古族漢化等因素的影響[16]。

綜上所述，基因檢測(cè)技術(shù)開拓了疾病病因診斷的新思路，本研究共發(fā)現(xiàn)2例BRCA1基因致病性突變，BRCA1突變可能參與了TNBC的發(fā)生、臨床分期和發(fā)展；統(tǒng)計(jì)分析得出內(nèi)蒙古地區(qū)TNBC BRCA1基因exon11的突變率差異無(wú)種族差異性，但由于蒙古族乳腺癌樣本量有限，盡管平衡了引起乳腺癌的其他危險(xiǎn)因素，但結(jié)果仍可能產(chǎn)生一定的偏倚，可能與樣本量小、位點(diǎn)選擇、民族差異、地理環(huán)境等因素相關(guān)，因此，有必要設(shè)計(jì)嚴(yán)密的大樣本、多中心研究，一方面可以提高檢出率，發(fā)現(xiàn)其在乳腺癌臨床診斷、分型和治療中有無(wú)應(yīng)用前景。另一方面，本研究結(jié)果顯示，BRCA1基因突變均發(fā)生在三陰乳腺癌病例中，極有可能與TNBC的發(fā)生、臨床分期和發(fā)展有關(guān)，因此，有乳腺癌家族遺傳史的TNBC患者及其女性家庭成員強(qiáng)烈推薦進(jìn)行BRCA基因突變檢測(cè)。