李燕靈，林夏飛

0 引言

銀杏達(dá)莫注射液是由銀杏提取物和雙嘧達(dá)莫制成，臨床上用于治療冠心病、高血壓等疾病[1]，銀杏葉提取物的活性成分主要為銀杏黃酮和銀杏萜內(nèi)酯[2]。雙嘧達(dá)莫是一種傳統(tǒng)的心血管系統(tǒng)藥物，其具有抗凝及擴張冠狀動脈的效果[3]。銀杏達(dá)莫注射液對于預(yù)防心肌缺血-再灌注損傷具有顯著的改善效果[4]。有些研究對銀杏達(dá)莫注射液的成分進(jìn)行研究，但是主要為雙嘧達(dá)莫和槲皮素等[5]，尚未有研究人員對銀杏達(dá)莫中的氨基酸含量進(jìn)行分析，并且對于銀杏達(dá)莫與其他藥物配伍方面，也未見有銀杏達(dá)莫與維生素C配伍穩(wěn)定性的相關(guān)報道。為了對銀杏達(dá)莫產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)行進(jìn)一步控制，本研究對銀杏達(dá)莫中氨基酸含量進(jìn)行分析，并觀察銀杏達(dá)莫與維生素C配伍的穩(wěn)定性，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 所需試劑 銀杏達(dá)莫注射液(A企業(yè)，批號：20161202；B企業(yè)，批號：161033；C企業(yè)，批號：160915)；甲醇、乙酸(美國Tedia公司)；17 種氨基酸混合溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) GBW(E) 100062(購自中國計量科學(xué)研究院)；維生素C標(biāo)準(zhǔn)品(購自中國藥品生物制品檢定所，規(guī)格：100 mg/瓶，批號：162139C)，維生素C注射液[購自北京雙鶴藥業(yè)，批號：A201701182，規(guī)格：含維生素C(C6H8O6)2 g]；甲醇、乙酸為色譜純，其他試劑均為分析純試劑。

1.1.2 主要儀器 Agilent 1200 型高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)；Veriti BP113D型分析電子天平(德國賽多利斯股份公司)；1300 A2型超聲清洗器(北京六一儀器廠)；D116C型高壓滅菌器(日本SANYO公司)；Mlilli-QM超純水純化儀(德國默克密理博公司)。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱為Venusil ASB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，色譜柱及樣品的溫度為25 ℃，流速為0.5 ml/min，上樣量為3 μl；流動相：A相為0.15%(v/v)的乙酸水溶液，B相為含0.9%(v/v)的乙酸和30%(v/v)的甲醇水溶液。梯度程序：0～2.5 min，100%A；2.5～5 min，0～17% B；5～8 min，17%～33% B；8～8.5 min，33%～100% B；8.5～17 min，100%B。

1.2.2 檢測樣品溶液制備 使用0.22 μm濾膜將配伍比例為5∶1的銀杏達(dá)莫注射液、維生素C注射液過濾，取200 μL樣品溶液待測。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備 取17種氨基酸混合溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) 200 μl，加水800 μl。得到混合標(biāo)準(zhǔn)儲液。依次取混合標(biāo)準(zhǔn)儲液 25、50、100、200、400 μl，分別加水至1 000 μl，得5個系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

精密稱取維生素C標(biāo)準(zhǔn)品0.1 g，加流動相定容至100 ml，使標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度為1 mg/ml，用移液器吸取1 ml加入至容量管中，加入流動相至終濃度為20 μg/ml，作為最終標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2.4 重復(fù)性及再現(xiàn)性 采用同樣方法，在第1次測定后1 d內(nèi)測定200 μl樣品溶液，計算日內(nèi)重復(fù)性的變異系數(shù)。采用同樣方法在第1次測定后3 d測定200 μl樣品溶液，計算日間重復(fù)性的變異系數(shù)。

1.2.5 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 采用外標(biāo)法考察氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以氨基酸峰面積作為縱坐標(biāo)，以氨基酸濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到17種氨基酸的回歸方程。

1.2.6 檢出限 使用相應(yīng)的軟件對結(jié)果進(jìn)行計算，檢出限(LOD)=各目標(biāo)物色譜峰的信噪比(S/N)。

1.2.7 配伍變化情況 在室溫(20±1) ℃及不避光的條件下，分別在0、1、2、4、8、12、24 h觀察配伍溶液的外觀變化情況，測定配伍溶液的pH值，并檢測配伍溶液不溶性微粒數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線情況 以氨基酸峰面積為縱坐標(biāo)，氨基酸濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到17種氨基酸的回歸方程。其中相關(guān)系數(shù)最高為Leu的0.999 7，最低為Met的0.995 7，檢出限最高為His的4.04 μmol/L，最低為Asp的1.16 μmol/L，見表1。

2.2 加標(biāo)回收率情況 對3種銀杏達(dá)莫注射液檢測后各氨基酸的加標(biāo)回收率進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果顯示，3種銀杏達(dá)莫注射液加標(biāo)回收率最高的氨基酸均為Pro (107.0%、104.0%、105.2%)，最低分別為Gly (75.4%)、Glu (76.1%)、Phe (75.8%)，精密度最高為Ile (5.06%)，最低為Gly (1.43%)。見表2。

2.3 游離氨基酸含量 對3種銀杏達(dá)莫注射液中17種游離氨基酸的含量進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果顯示，3種銀杏達(dá)莫注射液中17種游離氨基酸的含量最高均為Leu (6.12、6.39、6.33 mg/g)，所有3種銀杏達(dá)莫注射液中17種游離氨基酸的平均總含量為61.26。見表3。

表1 銀杏達(dá)莫中17種游離氨基酸的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限

表2 銀杏達(dá)莫中17種游離氨基酸的加標(biāo)回收率及精密度(%)

2.4 銀杏達(dá)莫與維生素C配伍溶液外觀及pH值變化情況 對3種銀杏達(dá)莫注射液與維生素C配伍溶液不同時間的外觀及pH值變化情況進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果顯示，所有3種銀杏達(dá)莫注射液與維生素C配伍后的溶液24 h內(nèi)外觀檢測和觀察均未出現(xiàn)沉淀、渾濁情況，并且無氣體產(chǎn)生，也無顏色變化，pH值呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢。見表4。

2.5 銀杏達(dá)莫與維生素C配伍溶液不溶性微粒數(shù) 對3種銀杏達(dá)莫與維生素C配伍的溶液中不溶性微粒數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果顯示，3種銀杏達(dá)莫與維生素C配伍的溶液中≥10 μm的不溶性微粒數(shù)隨時間增加而緩慢增加，而≥25 μm的不溶性微粒數(shù)隨時間增加基本無變化。見表5。

表3 銀杏達(dá)莫中17種游離氨基酸的含量

表4 配伍溶液不同時間外觀及pH值情況

表5 配伍溶液不同時間不溶性微粒數(shù)(粒/ml)

3 討論

王倬晅等[6]研究顯示，高效液相色譜可以有效、簡便、精確地測定銀杏達(dá)莫注射液水解前蘆丁、槲皮素的含量。任潔等[7]認(rèn)為，高效液相色譜可用于銀杏達(dá)莫氯化鈉注射液的質(zhì)量控制。王芮等[8]采用高效液相色譜對銀杏達(dá)莫注射液中雙嘧達(dá)莫含量進(jìn)行測定，認(rèn)為高效液相色譜可以用于銀杏達(dá)莫注射液的質(zhì)量控制。李榮等[9]觀察銀杏達(dá)莫與三磷酸胞苷二鈉注射液配伍的穩(wěn)定性，認(rèn)為兩種藥物在配伍后6 h內(nèi)外觀、pH值及峰形均無明顯變化，含量在4 h后明顯下降。兩種藥物在0.9%氯化鈉注射液或5%葡萄糖注射液中可配伍使用，但應(yīng)在4 h內(nèi)使用完。寧小艷等[10]認(rèn)為，銀杏達(dá)莫注射液可以與0.9%氯化鈉注射液、5%葡萄糖注射液、10%葡萄糖注射液配伍使用。陳玲玲等[11]認(rèn)為，銀杏達(dá)莫注射液與阿昔洛韋注射液存在配伍禁忌。范翠瓊等[12]認(rèn)為，銀杏達(dá)莫與奧硝唑注射液混合后不穩(wěn)定性風(fēng)險增加，不建議混合使用。何正有等[13]認(rèn)為，銀杏達(dá)莫注射液與吡拉西坦、維生素B6、硝酸甘油和多索茶堿可以配伍使用，而銀杏達(dá)莫注射液不宜與三磷酸胞苷二鈉、尼莫地平和奧扎格雷鈉配伍使用。張念森等[14]研究顯示，在室溫下，24 h維生素C和維生素K1的配伍液出現(xiàn)渾濁；而與肌苷注射液的配伍外觀無變化，但pH值及含量有變化，即溶液的穩(wěn)定性發(fā)生變化。葉剛等[15]認(rèn)為，丹參注射液與維生素C注射液配伍后的pH值和不溶性顆粒無明顯變化，溶液顏色有變化，有效成分含量變化較大。

本研究中未能檢測到銀杏達(dá)莫注射液與維生素C注射液配伍后的溶液中的小肽類成分，并且對檢測樣品中的同分異構(gòu)體仍無法分辨，因此，應(yīng)優(yōu)化檢測方法，開發(fā)新的檢測方法，提高對衍生產(chǎn)物的檢測速度及選擇性，開發(fā)新的檢測試劑配伍，提高各種檢測試劑及衍生產(chǎn)物的穩(wěn)定性，提高同分異構(gòu)體和衍生物的檢出率和正確率。

通過本研究，我們可以明確分析銀杏達(dá)莫注射液中17種游離氨基酸的含量，并且通過高效液相色譜技術(shù)，分析銀杏達(dá)莫可以與維生素C配伍使用，所以我們認(rèn)為，高效液相色譜技術(shù)可以用于銀杏達(dá)莫注射液的質(zhì)量控制以及分析其與維生素C的配伍使用情況。