劉 博，戚 誠*，趙 爽，趙曉東，劉學(xué)臣，張立超，石 暢

0 引言

胰腺癌惡性度高，早期發(fā)現(xiàn)困難，預(yù)后差，生存期短，化療敏感性差[1]。胰腺癌手術(shù)治療后治愈率也極低，轉(zhuǎn)移率高。對(duì)靶基因的篩選并尋找治療靶點(diǎn)，是胰腺癌治療的主要方向，也是可能延長生存期的治療手段[2]。吉西他濱(Gemcitabine，Gem)是一種細(xì)胞周期特異性的抗代謝化療藥，在DNA合成期(S期)殺滅腫瘤細(xì)胞，將癌細(xì)胞自G1期向S期的進(jìn)展阻斷[3]。AFAP-1L2 (Actin filament-associated protein 1-like 2，XB130)是一種接頭蛋白，與腫瘤的增殖、凋亡、侵襲及轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為相關(guān)[4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌細(xì)胞AFAP-1L2在mRNA、蛋白水平高表達(dá)，促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖，抑制凋亡[5-6]。本研究采用siRNA (小干擾RNA)下調(diào)胰腺癌細(xì)胞株中AFAP-1L2表達(dá)，并給予吉西他濱化療干預(yù)，旨在觀察AFAP-1L2基因下調(diào)對(duì)胰腺癌細(xì)胞吉西他濱化療敏感性的影響，為胰腺癌治療靶點(diǎn)的選擇提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人胰腺癌細(xì)胞MiaPaCa-2購自中科院上海細(xì)胞庫，以1640培養(yǎng)基行貼壁細(xì)胞培養(yǎng)、傳代。AFAP-1L2山羊多克隆抗體(sc-138089)購自美國Santa Cruz公司。DAB顯色試劑盒購自美國SIGMA公司，BCA定量及ECL發(fā)光試劑盒均購自南京凱基生物公司。逆轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增試劑盒、TRIzol(日本Takara公司)。LipofectamineTM2000、miRNA提取分離試劑盒、TRIzol、RPIM1640(大連寶生生物技術(shù)有限公司)。引物在北京生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)及合成。MTT試劑盒(美國Invitrogen 公司)，All-in-OneTMqPCR Mix試劑盒、Annexin V-FITC/PI試劑盒(美國GeneCopoeia公司)。siAFAP-1L2及siNegative Control質(zhì)粒由美國Addgene公司設(shè)計(jì)合成。

1.2 研究方法

1.2.1 實(shí)時(shí)定量PCR (qRT-PCR)法 依據(jù)RNA分離試劑盒及Trizol試劑說明書規(guī)定步驟進(jìn)行細(xì)胞RNA提取并純化，按照逆轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增試劑盒說明書步驟逆轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增。取樣品的RNA給予純度和完整性測定，符合純度高、不存在蛋白質(zhì)及DNA污染、總RNA抽取條件的完整細(xì)胞行PCR。各組細(xì)胞的cDNA為模板，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，反應(yīng)體系：2×All-in-One qPCR Mix 10 μl，45×Syber Green 2 μl，Primer F 1 μl，Primer R 1 μl，cDNA 2 μl，ddH2O 4 μl。反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 2 min；95 ℃ 20 s；60 ℃ 30 s；75 ℃ 30 s(共45個(gè)循環(huán))，采用ΔΔCT法進(jìn)行不同組別基因差異表達(dá)的比較。

1.2.2 siAFAP-1L2及siNegative Control轉(zhuǎn)染MiaPaCa-2細(xì)胞 試驗(yàn)分組：轉(zhuǎn)染siAFAP-1L2的siAFAP-1L2組，轉(zhuǎn)染siNegative Control的siNegative control組。按照LipofectamineTM2000說明書步驟對(duì)對(duì)數(shù)期生長且24 h內(nèi)融合達(dá)75%～95%的MisPaCa-2細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后，應(yīng)用Western blot、qRT-PCR法對(duì)AFAP-1L2蛋白、mRNA水平的轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行檢測，轉(zhuǎn)染效率約75%。

1.2.3 四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法(Methyl-thiazolyl-tetrazolium，MTT) 取對(duì)數(shù)期生長MiaPaCa-2細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，依照MTT試劑盒說明，將細(xì)胞以1×104/孔密度接種于96孔的細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，并設(shè)立3個(gè)復(fù)孔，常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)步驟進(jìn)行培養(yǎng)，每孔內(nèi)加5 mg/ml的MTT液 5 μl，在37 ℃條件下繼續(xù)溫育4 h，棄上清，每孔DMSO液150 μl，進(jìn)行水平振蕩將結(jié)晶溶解，以酶聯(lián)免疫檢測法測定各孔的吸光度，重復(fù)3次試驗(yàn)取平均值，繪制生長曲線。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 將轉(zhuǎn)染后傳代的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到EP管消化，按Annexin V/PI試劑盒操作說明進(jìn)行凋亡檢測，取對(duì)數(shù)生長期的MiaPaCa-2細(xì)胞，以EDTA胰酶進(jìn)行消化，采用 4 ℃預(yù)冷的PBS進(jìn)行2次洗滌，離心條件為4 ℃下，300 r/min，重懸細(xì)胞，將濃度調(diào)整為1×106/ml。將100 μl細(xì)胞懸液加入流式管，添加Annexin V-FITC (5 μl)、PI (10 μl)，在避光、室溫條件下反應(yīng)15 min，然后加入400 μl PBS，混勻后1 h內(nèi)，樣品置于流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。記錄早期凋亡百分率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 siAFAP-1L2轉(zhuǎn)染對(duì)胰腺癌細(xì)胞MiaPaCa-2增殖的影響 分別以不同濃度梯度(3.125、6.25、12.5、25、50、100、200 nmol/L)的siAFAP-1L2轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞48 h后，與siNegative control組比較，12.5、25、50、100、200 nmol/L轉(zhuǎn)染siAFAP-1L2組細(xì)胞存活率較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在培養(yǎng)24、48、72、96 h后，MiaPaCa-2細(xì)胞與siNegative control組比較，轉(zhuǎn)染siAFAP-1L2組細(xì)胞在48 h后存活率較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；siAFAP-1L2轉(zhuǎn)染后細(xì)胞存活率與siAFAP-1L2轉(zhuǎn)染濃度和時(shí)間具有相關(guān)性(r=-0.921，r=-0.907)。見圖1。下調(diào)AFAP-1L2表達(dá)降低胰腺癌細(xì)胞的存活率，并具有劑量、時(shí)間依賴性。

2.2 siAFAP-1L2轉(zhuǎn)染對(duì)胰腺癌細(xì)胞化療藥Gem敏感性的影響 將化療藥Gem 20 nmol/L加入分別以不同濃度梯度(3.125、6.25、12.5、25、50、100、200 nmol/L)siAFAP-1L2轉(zhuǎn)染的胰腺癌細(xì)胞，48 h后，與siNegative control組比較，25、50、100、200 nmol/L各轉(zhuǎn)染siAFAP-1L2組細(xì)胞存活率較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；將化療藥Gem 20 nmol/L加入siAFAP-1L2 100 nmol/L轉(zhuǎn)染的胰腺癌MiaPaCa-2細(xì)胞，培養(yǎng)24、48、72、96 h后，與siNegative control組比較，Gem對(duì)各濃度轉(zhuǎn)染siAFAP-1L2組細(xì)胞在72、96 h后存活率較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；siAFAP-1L2轉(zhuǎn)染后在Gem化療細(xì)胞存活率與siAFAP-1L2轉(zhuǎn)染濃度和時(shí)間具有相關(guān)性(r=-0.967，r=-0.984)。見圖2。下調(diào)siAFAP-1L2表達(dá)可以增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱的敏感性，并具有時(shí)間依賴性及劑量依賴性。

2.3 siAFAP-1L2轉(zhuǎn)染及化療藥Gem對(duì)MiaPaCa-2細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡顯示，siAFAP-1L2+Gem組、siAFAP-1L2組的凋亡率分別為37.28%、11.65%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。siAFAP-1L2可以增強(qiáng)吉西他濱對(duì)胰腺癌細(xì)胞的殺傷作用。

3 討論

胰腺癌是惡性度最高的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其1年生存率低于25%，而5年生存率更是低于5%。確診時(shí)80%以上患者已經(jīng)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[7]。近年以手術(shù)為基礎(chǔ)的放療、化療等綜合治療手段沒有顯著提高胰腺癌的生存期及降低病死率[8]。作為細(xì)胞周期特異性抗代謝抗癌藥，吉西他濱作用于腫瘤細(xì)胞的S期，阻止細(xì)胞從G1期向S期進(jìn)展，在胰腺癌化療中具有良好的療效，一定程度上提高了患者的生存期，但是化療的總體療效仍然非常有限[9]?；煾郊影邢蛑委熞呀?jīng)成為腫瘤治療的主要綜合治療方式[10]。本研究對(duì)AFAP-1L2表達(dá)進(jìn)行下調(diào)，觀察其對(duì)胰腺癌細(xì)胞的作用及其對(duì)吉西他濱化療是否具有增效作用。

圖1 MTT檢測不同濃度梯度及培養(yǎng)不同時(shí)間MiaPaCa-2細(xì)胞存活率

圖2 MTT檢測Gem干預(yù)下不同濃度梯度及培養(yǎng)不同時(shí)間MiaPaCa-2細(xì)胞存活率

本研究顯示，siAFAP-1L2轉(zhuǎn)染后，胰腺癌細(xì)胞存活率與siAFAP-1L2轉(zhuǎn)染濃度和時(shí)間具有相關(guān)性，濃度越高或作用時(shí)間越長，胰腺癌細(xì)胞存活率越低。下調(diào)AFAP-1L2表達(dá)降低胰腺癌細(xì)胞的存活率，并具有劑量及時(shí)間依賴性。本課題組前期研究顯示，AFAP-1L2在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中高表達(dá)，預(yù)示胰腺癌預(yù)后不良，是胰腺癌的預(yù)后獨(dú)立預(yù)測因素[5-6]。AFAP-1L2作用于下游PI3K/Akt信號(hào)通路，通過α-Akt磷酸化對(duì)PI3K/Akt通路活性進(jìn)行調(diào)控，下調(diào)AFAP-1L2表達(dá)后阻斷了PI3K/Akt信號(hào)通路，從而降低了胰腺癌細(xì)胞的存活率。本研究進(jìn)一步顯示，siAFAP-1L2轉(zhuǎn)染后，在Gem化療細(xì)胞存活率與siAFAP-1L2轉(zhuǎn)染濃度和時(shí)間存在相關(guān)性。下調(diào)siAFAP-1L2表達(dá)可以增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱的敏感性，并具有時(shí)間、劑量依賴性。siAFAP-1L2促進(jìn)吉西他濱干預(yù)胰腺癌細(xì)胞的凋亡，增強(qiáng)吉西他濱對(duì)胰腺癌細(xì)胞的殺滅作用，下調(diào)AFAP-1L2表達(dá)可以使吉西他濱化療增效。前期對(duì)AFVAP-1L2作用機(jī)制的研究也顯示，AFAP-1L2下調(diào)減弱了MiaPaCa-2細(xì)胞增殖能力，停留在G1期細(xì)胞增多，在G2、S期比例減少，凋亡增加[5-6]。對(duì)AFAP-1L2表達(dá)進(jìn)行干擾，可降低胰腺癌細(xì)胞的增殖能力，并使其停留在G1期細(xì)胞增多，凋亡率升高，PI3K/Akt信號(hào)通路受到抑制，磷酸化α-Akt減少，從而起到對(duì)胰腺癌細(xì)胞的殺滅作用。Shiozaki等[11]研究顯示，AFAP-1L2通過調(diào)控下游信號(hào)通路PI3K/Akt，促進(jìn)α-Akt磷酸化，該通路對(duì)下游酪氨酸及色氨酸殘基進(jìn)一步磷酸化，從而調(diào)控細(xì)胞周期、增殖及侵襲等行為。Zheng等[12]研究認(rèn)為，抑制PI3K/Akt信號(hào)通路后，增殖及凋亡等胰腺癌細(xì)胞的活性減弱，同時(shí)增加腫瘤細(xì)胞對(duì)厄洛替尼化療敏感性。

綜上所述，下調(diào)AFAP-1L2表達(dá)可增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞吉西他濱化療敏感性，促進(jìn)對(duì)胰腺癌細(xì)胞的殺傷作用，AFAP-1L2可作為胰腺癌治療靶向候選基因。