王萬(wàn)鵬，唐伯玉，沈劍簫，李永剛，蒯巧林，高甄典，李娟，梁森林，陳皓瑜

（1.江蘇省漣水縣人民醫(yī)院，江蘇 淮安 225400；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院，上海 200127）

慢性腎臟?。╟hronic kidney disease,CKD）與足細(xì)胞損傷常常互為因果，足細(xì)胞損傷機(jī)制極其復(fù)雜，多種理化、生物因素均可影響足細(xì)胞的功能。本研究擬采用加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（weighted gene coexpression network analysis,WGCNA）挖掘從美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information,NCBI）的基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（gene expression omnibus,GEO）下載到的足細(xì)胞損傷體外模型以及CKD患者腎小球表達(dá)譜數(shù)據(jù)集，分析CKD狀態(tài)下腎小球足細(xì)胞損傷后加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，識(shí)別CKD狀態(tài)下足細(xì)胞損傷的相關(guān)基因模塊及模塊內(nèi)樞紐（hub）基因，為進(jìn)一步探索CKD足細(xì)胞損傷的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制提供一種新思路。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源

下載數(shù)據(jù)集GSE66107、GSE93798，GSE30528、GSE32591和GSE99339，其中GSE66107為嘌呤霉素氨基核苷（purinomycin amino nucleoside,PAN）誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷體外模型；GSE93798、GSE30528、GSE32591分別為通過(guò)激光微切割獲得的IgA腎病、糖尿病腎?。╠iabetic kidney disease,DKD）、狼瘡性腎炎（lupus nephritis,LN）患者腎小球mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)，以上4個(gè)數(shù)據(jù)集用于差異表達(dá)基因（differentially expressed genes,DEG）分析；數(shù)據(jù)集GSE99339由多種CKD患者腎小球表達(dá)譜數(shù)據(jù)構(gòu)成，疾病包括：LN、IgA腎病、膜性腎小球腎炎（membranous glomerulonephritis,MGN）、高血壓性腎?。╤ypertensive nephropathy,HT）、局灶節(jié)段性腎小球硬化（focal segmental glomerulosclerosis,FSGS）、腎腫瘤切除（tumor nephrectomy,TN）、微小病變腎?。╩inimal change disease,MCD）、DKD、 薄 基 膜 病（thin membrane disease,TMD），共133例患者用于WGCNA分析。見(jiàn)表1。芯片的探針注釋信息來(lái)自Affymetrix公司下載的原始文件。

1.2 數(shù)據(jù)預(yù)處理

采用R語(yǔ)言（3.4.0版）中的Affy包對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，包括ReadAffy函數(shù)讀取原始文件（后綴名為.CEL）；全局歸一化矯正（Robust Muti-array Average,RMA）函數(shù)歸一化及對(duì)數(shù)化；mas5calls函數(shù)檢測(cè)基因表達(dá)情況，函數(shù)結(jié)果表現(xiàn)為“表達(dá)（P）”或“缺失（A）”，本研究選擇在各數(shù)據(jù)集樣本中表達(dá)超過(guò)50%的探針用于后續(xù)研究；KNN法補(bǔ)充缺失值；limma包進(jìn)行差異表達(dá)值計(jì)算，并用貝葉斯方法進(jìn)行多重檢驗(yàn)校正，最終選取閾值錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate,FDR）＜0.05及倍數(shù)變化（fold change,FC）≥1.5得到DEG。

1.3 WGCNA

1.3.1 模塊構(gòu)建及可視化 GSE99339數(shù)據(jù)集包含5個(gè)批次（bacth），使用sva包中ComBat函數(shù)去除批次效應(yīng)后運(yùn)行WGCNA包進(jìn)行基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與模塊鑒定。共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)模塊內(nèi)各基因利用DAVID 6.7（https://david.ncifcrf.gov/）在線工具進(jìn)行基因本體（gene ontology,GO）分析。利用Cytoscape繪制WGCNA導(dǎo)出的加權(quán)共表達(dá)基因網(wǎng)絡(luò)，并通過(guò)插件Cluego（v2.3.5）與 Cluepedia（v1.3.5）關(guān)聯(lián) String 數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行模塊內(nèi)基因GO（功能）和京都基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）通路富集分析與蛋白間互作網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interactions,PPI）可視化分析。Gluego插件參數(shù)設(shè)置為pV≤0.05，其余為默認(rèn)參數(shù)。

1.3.2 足細(xì)胞特異性陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)基因 JU等[1]在過(guò)去的研究中使用高通量數(shù)據(jù)以機(jī)器學(xué)習(xí)為基礎(chǔ)發(fā)展處一種迭代算法，通過(guò)該算法分別定義統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的50種足細(xì)胞特異性標(biāo)準(zhǔn)基因（podocyte standard gene,PSG）。PSG包括：ACTN4、NPHS1及NPHS2等。

表1 數(shù)據(jù)集納入及分析結(jié)果

2 結(jié)果

2.1 足細(xì)胞損傷體外模型及CKD患者腎小球差異表達(dá)基因分析

經(jīng)過(guò)預(yù)處理并刪除低表達(dá)探針（表達(dá)率＜50%數(shù)據(jù)集樣本數(shù)）后剩余探針?lè)謩e為26 357、11 118、11 296及7 194個(gè)，合并重復(fù)探針和刪除無(wú)注釋探針后，最終分別得到6 154、3 882、1 422、840個(gè)DEG（FDR＜0.05，F(xiàn)C≥1.5）（見(jiàn)表1）。使用R語(yǔ)言ggplot包繪制DEG熱圖，可見(jiàn)所得DEG可以區(qū)分出大部分CKD患者或者損傷的足細(xì)胞（見(jiàn)圖1A～D）。本研究4個(gè)數(shù)據(jù)集共得到9 217個(gè)DEG，共同DEG（coDEG）15個(gè)，其中上調(diào)基因4個(gè)（見(jiàn)圖1E），下調(diào)基因11個(gè)（見(jiàn)圖1F），分別為CDKN1C，MYO5C，C1orf21，KBTBD11，NR3C2，F(xiàn)ZD2，MAGI2，LPL，ZFPM2，USP46，PRKAR2B，TRIM38，DESI1，CTSS，ITGB2。

2.2 WGCNA構(gòu)建基因共表達(dá)模塊

9 217 個(gè)DEG中有1 260個(gè)DEG表達(dá)趨勢(shì)在2個(gè)或2個(gè)以上數(shù)據(jù)集中存在相反（與對(duì)照組比較），刪除后剩余7 957個(gè)DEG，其中4 031個(gè)DEG存在于GSE99339預(yù)處理后的表達(dá)譜中，被用于WGCNA分析（見(jiàn)表1）。網(wǎng)絡(luò)模塊分析結(jié)果易受離群樣本的影響，因此在構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)之前去除離群的樣本數(shù)據(jù)顯得尤為重要。相關(guān)研究常采用芯片間相關(guān)度（inter.array correlation,IAC）來(lái)評(píng)估芯片數(shù)據(jù)的分布情況。IAC可以通過(guò)計(jì)算任意一對(duì)芯片上所有探針表達(dá)水平的相關(guān)系數(shù)獲得，芯片之間的關(guān)系可以用樹(shù)形圖來(lái)展示，平均IAC值較低的樣本，或者在樹(shù)形圖上無(wú)法聚類的樣本即為離群樣本，應(yīng)被去除。本研究使用WGCNA包中的函數(shù)dist（）計(jì)算樣本間的IAC，并通過(guò)hclust（）函數(shù)繪制133個(gè)樣本4 031個(gè)DEG構(gòu)成的樹(shù)形圖，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)明顯離群值和疾病聚集（見(jiàn)圖2A）；根據(jù)動(dòng)態(tài)分層剪切樹(shù)算法最終得到12個(gè)基因模塊（見(jiàn)圖2B），以顏色的英文命名，其中g(shù)rey模塊包含518個(gè)DEG，表示未納入任何模塊的基因集合。

2.3 足細(xì)胞損傷相關(guān)基因模塊鑒定及分析

12個(gè)基因模塊與未歸類的grey模塊（見(jiàn)表2），本研究中共包含PSG 22個(gè)，其中尤以green和red模塊最多，分別為10和4個(gè)。同時(shí)通過(guò)DAVID進(jìn)行模塊內(nèi)基因功能富集發(fā)現(xiàn)green和red模塊所含基因與腎小球發(fā)育、細(xì)胞外基質(zhì)解聚、細(xì)胞機(jī)械刺激等足細(xì)胞常見(jiàn)的病理狀態(tài)密切相關(guān)，因此筆者認(rèn)為這兩個(gè)模塊與足細(xì)胞損傷關(guān)系較為密切。另一方面，與兩個(gè)模塊比較，發(fā)現(xiàn)green模塊中包含更多的coDEG，因此可以推測(cè)green模塊中的基因可能參與多種CKD發(fā)展中 的足細(xì)胞損傷。

圖1 各數(shù)據(jù)集差異基因表達(dá)熱圖及韋恩圖

圖2 WGCNA分析構(gòu)建基因共表達(dá)模塊

2.4 足細(xì)胞損傷相關(guān)模塊加權(quán)網(wǎng)絡(luò)分析

hub基因是指在模塊中連接度最高的一系列基因，與全局網(wǎng)絡(luò)中的樞紐基因比較，模塊中的樞紐基因往往更有生物學(xué)意義。本文定義的WGCNAhub基因?yàn)槟K內(nèi)平均連接度（Kwithin）前5%的基因[2]。結(jié)果顯示，green模塊中MAGI2基因可以同時(shí)作為即是green模塊的hub基因也是本研究中的coDEG和PSG（見(jiàn)表2），結(jié)果高度提示MAGI2不僅具有CKD足細(xì)胞損傷的分子標(biāo)志物潛在價(jià)值，也可能在早期足細(xì)胞損傷中起到重要生物學(xué)作用。選擇關(guān)聯(lián)權(quán)重閾值≥0.05構(gòu)建mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)（見(jiàn)圖4A），并使用Cytoscape及ClueGO插件并聯(lián)合String數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建green模塊內(nèi)所有基因的KEGG/GO/PPI互作網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步挖掘模塊內(nèi)基因參與的生物學(xué)進(jìn)程及蛋白相互作用，結(jié)果顯示與MAGI2表達(dá)或蛋白互作高度相關(guān)的多種基因已經(jīng)被報(bào)道參與足細(xì)胞損傷，包括NPHS2、FGF1、BMP7等（見(jiàn)圖4B）。

表2 構(gòu)建出的模塊資料及所含基因總結(jié)

圖3 各模塊功能富集結(jié)果（取P值最小前3項(xiàng)）

圖4 green模塊內(nèi)基因功能及相互作用網(wǎng)絡(luò)可視化

3 討論

CKD時(shí)足細(xì)胞損害機(jī)制極其復(fù)雜，涉及多種通路及細(xì)胞因子[3]。但傳統(tǒng)的生物學(xué)研究以單基因或蛋白為出發(fā)點(diǎn)，因此其僅能對(duì)生物系統(tǒng)的局部作出解釋，難以對(duì)系統(tǒng)的整體進(jìn)行全面的探索。相比之下，WGCNA是一種從高通量數(shù)據(jù)中挖掘模塊（module）信息的算法。在本方法中module被定義為一組具有類似表達(dá)譜的基因，如果某些基因在一個(gè)生理過(guò)程或不同組織中總是具有相類似的表達(dá)變化，那么有理由認(rèn)為該基因在功能上是相關(guān)的，可以把其定義為一個(gè)模塊（module）。這似乎有點(diǎn)類似于進(jìn)行聚類分析所得結(jié)果，但不同的是，WGCNA的聚類準(zhǔn)則具有生物學(xué)意義，而非常規(guī)的聚類方法（如利用數(shù)據(jù)間的幾何距離），因此該方法所得結(jié)果具有更高的可信度，更有利于從生物功能整體入手考慮基因功能以及內(nèi)在關(guān)聯(lián)[4]。

本研究所納入的GSE66107數(shù)據(jù)集是PAN誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷的經(jīng)典體外模型，PAN是嘌呤霉素的衍生物，具有選擇性的腎損害作用，PAN所致的腎臟損傷與人類腎病損傷一致，早期表現(xiàn)為足細(xì)胞足突融合和消失的微小病變（MCD），隨著PAN作用時(shí)間的延長(zhǎng)和蓄積量的增加，足細(xì)胞凋亡增加，進(jìn)一步發(fā)展為局灶節(jié)段性腎小球硬化（FSGS），而PAN作用的靶細(xì)胞即為足細(xì)胞。因此通過(guò)足細(xì)胞體外損傷模型的基因表達(dá)變化與另3個(gè)CKD患者腎小球基因變化取交集，有利于排除腎臟其他實(shí)質(zhì)細(xì)胞（如系膜細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞）表達(dá)變化的干擾，可以更明確探討CKD時(shí)足細(xì)胞內(nèi)可能存在的基因表達(dá)異常。最終將4個(gè)數(shù)據(jù)集所得到的DEG結(jié)合含有133個(gè)CKD樣本表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行WGCNA分析，并通過(guò)GO富集分析現(xiàn)red和green模塊在GO分類上與多種足細(xì)胞損傷相關(guān)進(jìn)程較為密切：如機(jī)械刺激反應(yīng)（cell response to mechanical stimulus）[5]、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)（response to endoplasmic reticulum stress）[6-7]、腎小球發(fā)育（glomerulus development）、細(xì)胞外基質(zhì)分解[8]（extracellular matrix disassembly）等。更有價(jià)值的是，筆者發(fā)現(xiàn)green模塊中的hub基因MAGI2也同為本研究中的coDEG和PSG，同時(shí)，網(wǎng)絡(luò)可視化結(jié)果顯示MAGI2與多種文獻(xiàn)已報(bào)道的在足細(xì)胞損傷或腎臟病中起到重要“著名”基因相關(guān)量，如FGF1[9]、BMP7等[10]。這意味著MAGI2可能具有作為足細(xì)胞損傷早期分子標(biāo)志物的潛在價(jià)值，并且在足細(xì)胞損傷中起到重要的調(diào)控作用，同時(shí)通過(guò)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建識(shí)別其高度相關(guān)的節(jié)點(diǎn)基因，對(duì)后續(xù)MAGI2的調(diào)控機(jī)制研究提供重要線索。

本研究不足之處在于從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中下載的基因表達(dá)譜無(wú)法得到相應(yīng)的臨床資料，如腎小球?yàn)V過(guò)率（eGFR）、血肌酐（Scr）、尿蛋白等，如果可以加入該臨床參數(shù)作為參考，那么WGCNA分析時(shí)更可以將所得模塊與該臨床信息進(jìn)行相關(guān)性分析，挖掘模塊可能所具有的生物學(xué)意義，發(fā)揮WGCNA的更大作用。

綜上所述，本研究通過(guò)運(yùn)用一系列合理的生物信息學(xué)手段，分析CKD患者腎小球內(nèi)與足細(xì)胞損傷相關(guān)度的15個(gè)差異變化基因，同時(shí)通過(guò)共表達(dá)分析構(gòu)建出足細(xì)胞損傷相關(guān)基因模塊green，研究結(jié)果對(duì)于CKD，尤其是足細(xì)胞損傷的早期診斷提供線索，同時(shí)為足細(xì)胞保護(hù)相關(guān)研究提供依據(jù)及參考，是WGCNA在CKD足細(xì)胞損傷中的一次新型嘗試。