買買提·依斯熱依力 艾克拜爾·艾力 吾布力卡斯木·吾拉木 伊比提哈爾·買買提艾力 巴突爾·艾克木 王儉 艾熱夏提·吐洪江 曹正一 阿布拉江·米吉提 趙新勝 克力木·阿不都熱依木

隨著人類飲食結(jié)構(gòu)的變化，高能量值食物的攝取量不斷提高，由飲食結(jié)構(gòu)不合理引起的肥胖癥逐漸引起了人們的關(guān)注。在消化系統(tǒng)良性疾病中，很多疾病的發(fā)生與肥胖有關(guān)，其中常見的包括胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease，GERD)、非酒精性脂肪肝、膽囊結(jié)石及胰腺炎等[1]。同時肥胖癥的患病率在全球范圍內(nèi)不斷增長，已成為了一項世界公共健康問題。GERD同樣作為常見的消化道良性疾病，其與飲食習(xí)慣間的相關(guān)性不可忽視。近年國內(nèi)外許多研究者通過飲食誘導(dǎo)肥胖(diet-induced obesity，DIO)動物模型來探討肥胖和相關(guān)代謝性疾病的發(fā)病機制[2-3]。然而該模型在上述領(lǐng)域中被廣泛應(yīng)用，使得模型的成功建立已基本成熟，但其在GERD研究中的應(yīng)用很少見。因此本研究旨在探討肥胖與GERD的相關(guān)性及DIO動物模型在該研究中的價值，以為今后肥胖與GERD相關(guān)性研究提供實驗基礎(chǔ)。

資料與方法

一、一般資料

1. 實驗動物及分組：SPF級雄昆明小鼠20只，8周齡，購于新疆實驗動物研究中心，許可證號：SCXK(新)2011-0001；飼養(yǎng)于新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所IVC系統(tǒng)動物中心。研究員對20只小鼠進行編號及體質(zhì)量測量，并排除體重變異較大的4只。采用Microsoft Office Excel軟件隨機分2組(各8只)，即飲食誘導(dǎo)肥胖組(diet-induced obesity,DIO)組和正常對照(normal control，NC)組。小鼠以4只/籠飼養(yǎng)在自由進食水的鼠籠內(nèi)，每日給予12 h晝夜循環(huán)，光照均始于北京時間8∶30分，止于20∶30分。

2. 實驗器材:電子天平(EL-5.2K)，常州市天之平儀器設(shè)備有限公司；低溫高速離心機(1-14K)，德國Sigma公司；抗凝采血管，美國BD公司；光學(xué)顯微鏡(Eclipse E200)，日本尼康公司；三諾安穩(wěn)血糖儀及血糖試條，三諾生物傳感股份有限公司；D-葡萄糖，德國Sigma公司；HE染色相關(guān)試劑，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

二、方法

1. DIO模型的建立:正式實驗前，將所有小鼠在相同環(huán)境中標準飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。9周齡時開始建立模型，DIO組小鼠給予高脂飼料(HFD,Lot:11111401,60%KJ%fat,D12492,Research Diets Inc.21.92 KJ/g)，NC組給予標準飼料(STD，Lot：08101506,10%KJ%fat，D12450B，Research Diets Inc.16.11 KJ/g)，飼料成分見表1，其余處理均相同。實驗過程中小鼠自由飲水?dāng)z食，持續(xù)8周。每周3上午10∶00(北京時間)測量體質(zhì)量與飲食量。8周的飼養(yǎng)結(jié)束后，DIO組小鼠中體質(zhì)量超過NC組最高體質(zhì)量者可被視為肥胖小鼠。

表1 HFD與STD成份及能量值(%)

注：STD為標準飼料；HFD為高脂飼料

2. 取材與標本處理：實驗第8周最后1天下午17∶00(北京時間)開始對所有小鼠禁食，于次日11∶00(北京時間)進行取材。將麻醉的動物以平臥位固定，從腹部正中至劍突取3 cm切口，下腔靜脈取血注入于肝素抗凝采血管中。肉眼觀察皮下、腹股溝、腸系膜及各臟器周圍脂肪，完整游離取材并稱重；此外在距離胃食管交界處0.3和1.5 cm處剪斷取下胃食管組織，置于4%中性甲醛固定。

3. 血生化指標的測定：裝入采血管的血樣品以3 500 rpm/min的速度低溫離心5 min，取上層血清，-80 ℃保存，用于后續(xù)生化指標測定。采用ELISA法檢測甘油三酯，總膽固醇，低密度脂蛋白含量。實驗過程及測量指標濃度的計算嚴格按試劑盒說明書進行。

4. 口服葡萄糖耐量試驗(OGTT)與胰島素耐受試驗(ITT):參照Uchida[4]和Yisireyili等[5]研究者的方法進行實驗，步驟如下：實驗第8周最后1 d下午17∶00(北京時間)開始對所有小鼠禁食，于次日11∶00(北京時間取材前進行試驗。GTT：試驗開始前測血糖濃度，然后腹腔內(nèi)以2 g/kg的量注射D-葡萄糖，并在注射后30、60、90、120 min分別監(jiān)測血糖；ITT實驗：GTT試驗結(jié)束后向小鼠腹腔內(nèi)注射胰島素0.75 U/kg，其后分別在15、30、45、60 min分別檢測血糖并記錄。參照王科等[6]的實驗方法計算GTT、ITT曲線下面積(area under curve,AUC)。

5. 小鼠組織病理學(xué)檢查:4%中性甲醛固定24 h后水洗、脫水、透明、浸蠟、包埋，制成5 μm厚切片行HE染色。切片質(zhì)量及各組織形態(tài)學(xué)改變均由富有經(jīng)驗的病理科醫(yī)師診斷。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、NC組與DIO組小鼠體型、腹腔內(nèi)脂肪分布、體重、進食量及血糖的比較

DIO組小鼠在體型上明顯比NC組小鼠體型大，并且NC組小鼠被毛順滑，而DIO組小鼠的被毛普遍有出油的現(xiàn)象(見圖1A)；經(jīng)解剖腹腔2組進行比較發(fā)現(xiàn)，DIO組小鼠腸系膜、腹股溝及腹膜后等部位出現(xiàn)明顯的脂肪堆積(見圖1B,C,D)。體重為反應(yīng)小鼠機體整體狀況的基本指標。實驗開始前DIO組小鼠體質(zhì)量為(22.31±0.52)g，NC組小鼠體質(zhì)量為(22.60±0.31)g，2組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；8周的實驗過程中，DIO組小鼠平均每日進食量為(2.92±0.41)g，NC組為(2.68±0.30)g，2組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；實驗結(jié)束后DIO組小鼠體質(zhì)量增加量為(23.16±2.82)g，NC組小鼠體質(zhì)量增加量為(13.40±1.31)g，2組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表2。

二、NC組與DIO組小鼠血生化指標的比較

DIO組小鼠血漿總膽固醇，低密度脂蛋白水平明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，甘油三酯水平略高于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表3。

組別例數(shù)平均每日進食量(g)體重增加量(g)NC組82.68±0.3013.40±1.31DIO組82.92±0.4123.16±2.82t值-1.30-8.86P值0.210.000

表3 血生化指標比較

三、NC組與DIO組小鼠糖耐量和胰島素耐受的變化

GTT結(jié)果顯示，試驗開始之初NC組和DIO組小鼠血糖上升明顯，DIO組小鼠血糖2 h內(nèi)不能恢復(fù)之前濃度且維持在一個比較高的水平，而NC組2 h內(nèi)能恢復(fù)到正常范圍內(nèi)的濃度，經(jīng)過計算AUC得知，DIO組小鼠與NC組小鼠在整體水平上有差異(P<0.05)，由此可見，DIO組小鼠已經(jīng)出現(xiàn)了糖耐量異常的現(xiàn)象。ITT結(jié)果顯示，NC組小鼠血糖濃度有一次較大幅度的下降，2 h內(nèi)能夠恢復(fù)之前的濃度；而CRS組小鼠的血糖只是略有下降，2 h不能恢復(fù)到原來的濃度。同樣經(jīng)過計算曲線下面積得知，DIO組小鼠與NC組小鼠在整體水平上有差異(P<0.05)；說明胰島素已經(jīng)不能充分發(fā)揮其正常的生理功能，可以初步估計機體已經(jīng)出現(xiàn)了胰島素抵抗的現(xiàn)象，見圖2。

四、NC組與DIO組小鼠胃、食管組織學(xué)及其周圍脂肪的變化

經(jīng)解剖發(fā)現(xiàn)DIO組小鼠除了腹腔內(nèi)各部位脂肪嚴重堆積，在胃食管交界處周圍同樣出現(xiàn)了明顯的脂肪堆積；HE染色及鏡下觀察顯示，在DIO組小鼠食管胃組織可見充血，炎癥細胞(單核細胞、巨噬細胞)浸潤，但NC組未見明顯異常，見圖3。

圖3 2組小鼠胃食管外觀及組織病理學(xué)變化

討 論

隨著經(jīng)濟的發(fā)展，人們生活水平的提高，肥胖及相關(guān)消化道疾病人群的數(shù)量近年來呈現(xiàn)一個迅速上升的趨勢，對人類健康帶來了不同程度的危害。其中肥胖與GERD的相關(guān)性研究引起了越來越多的研究者的注意。GERD作為影響人類健康的消化道良性疾病之一，認為肥胖是其發(fā)生發(fā)展的重要因素[1]。全世界約10%～40%的成年人飽受著胃食管反流之痛[7]，同樣約有30%的人處于超重或肥胖狀態(tài)并呈逐年上升趨勢[8]。多項橫斷面流行病學(xué)研究報道稱，肥胖人群中GERD的發(fā)病率高于非肥胖人群[9-10]。El-Serag等[11]對453名醫(yī)院職工進行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，26%的人每周都會出現(xiàn)燒心或反流癥狀；其中196名職工愿意接受進一步調(diào)查并進行了胃鏡檢查，結(jié)果顯示，不同BMI組，即BMI<25、25～30和>30 kg/cm2，存在GERD癥狀者所占的比例分別是23.3%、26.7%、50%，而糜爛性食管炎者所占的比例分別為12.5%、29.8%、26.9%。此外在其他研究中發(fā)現(xiàn)，增重>5 kg的人出現(xiàn)GERD癥狀的危險性為正常人的2.7倍[12]。故，在上述研究的基礎(chǔ)上，本課題組通過建立DIO動物模型，觀察肥胖所引起食管、胃的變化。

建模過程中，長期進食高脂飼料的模型組小鼠，體質(zhì)量明顯高于標準飼料喂養(yǎng)組，其中75%的小鼠發(fā)育為DIO。整個造模期間，模型組小鼠體質(zhì)量呈緩慢增長，雖然飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠動物模型的建立耗時長達2個月，但此模型較為真實地模擬了人類肥胖癥患者的病因和體重增長過程，即由長期高熱量飲食和缺乏運動的生活狀態(tài)所致。此肥胖模型動物伴有糖耐量異常、胰島素抵抗和脂質(zhì)代謝紊亂，符合人類肥胖癥患者所具有的血液生化指標的變化，所以此模型可用于評價肥胖所誘導(dǎo)胃食管反流所引起的病理變化。對于該實驗中肥胖引起的胃食管的變化，我們發(fā)現(xiàn)DIO組小鼠腹腔內(nèi)各部位脂肪堆積嚴重，更重要的是在胃食管交界處周圍同樣出現(xiàn)了明顯的脂肪堆積，這一變化初步驗證了“肥胖是引起胃食管反流的病理基礎(chǔ)”之一。進一步通過HE染色觀察2組小鼠食管、胃組織形態(tài)學(xué)變化時發(fā)現(xiàn)，食管及胃組織上皮細胞增厚、黏膜層各類炎癥細胞的浸潤等變化。因為，在胃食管炎癥進展和糜爛形成時，通常在鏡下可見沿食管長軸有條狀糜爛病變，也可見病變區(qū)域上皮壞死脫落，形成淺表性上皮缺損，其上由炎性纖維素膜覆蓋，其下可見中性粒細胞及淋巴細胞，漿細胞浸潤，炎癥改變。因此，DIO小鼠胃食管組織出現(xiàn)的組織學(xué)變化，相對接近肥胖導(dǎo)致胃食管反流的一個重要的病理變化。

綜上所述，目前關(guān)于肥胖所引起的GERD發(fā)病原因和機制尚不清楚。臨床研究往往因不易獲取倫理批準或患者知情同意、無法及時全面觀察機體病理生理變化及各層組織形態(tài)學(xué)變化等因素而受到限制，而動物實驗?zāi)Ｐ偷慕⒔鉀Q了上述問題。然而DIO小鼠模型具有穩(wěn)定性及重復(fù)性較好，操作簡單、費用低等優(yōu)勢，并且整個造模期間，沒有動物死亡。因此，本實驗可以為后期進一步研究肥胖所引起GERD的機制提供較好的實驗基礎(chǔ)。