彭傳真 宋兆錄 李開艷 吳曉 冷寧

[摘要] 目的 探討血管緊張素受體AT1相關(guān)的受體蛋白（APJ）拮抗劑Apelin13（F13A）對腫瘤相關(guān)巨噬細胞極化及其誘導(dǎo)的乳腺癌細胞系MCF-7細胞遷移和侵襲的影響。 方法 用白細胞介素-13（IL-13）（10 ng/mL）處理RAW264.7細胞24 h誘導(dǎo)M2型極化（M2RAW），同時用Apelin-13（F13A）（10.00 pm/mL）共同處理24 h，再與MCF-7細胞非接觸共培養(yǎng)48 h。采用MTT法檢測RAW和MCF-7細胞的增殖。采用酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測RAW細胞培養(yǎng)液上清中TGF-β和IL-10水平。Western blot檢測RAW細胞中M2型極化標志蛋白Arg-1表達。劃痕實驗和Transwell實驗檢測MCF-7細胞的遷移和侵襲力。 結(jié)果 與RAW組比較，M2RAW組TGF-β、IL-10及Arg-1的表達水平均顯著增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；與M2RAW組比較，M2RAW+Apelin-13（F13A）組TGF-β、IL-10水平及Arg-1的表達水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。與RAW+MCF-7組比較，M2RAW+MCF-7組MCF-7細胞劃痕顯著減小，侵襲的細胞數(shù)明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；與M2RAW+MCF-7組比較，Apelin-13（F13A）+M2RAW+MCF-7組MCF-7細胞劃痕顯著增加，侵襲的細胞數(shù)明顯減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 Apelin13（F13A）可抑制巨噬細胞M2型極化及其誘導(dǎo)的乳腺癌細胞遷移和侵襲。

[關(guān)鍵詞] 血管緊張素受體AT1相關(guān)的受體蛋白；拮抗劑；乳腺癌；腫瘤侵襲；腫瘤相關(guān)巨噬細胞；M2型極化

[中圖分類號] R737.9 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）05（c）-0013-06

Effect of putative receptor protein related to the angiotensin receptor AT1 antagonist Apelin13 （F13A） on the invasion induced by M2 type tumor related macrophages in breast cancer cells line MCF-7 cells and probable mechanism

PENG Chuanzhen SONG Zhaolu LI Kaiyan WU Xiao LENG Ning

Department of Radiotherapy， Jiaozhou Central Hospital of Qingdao City， Shandong Province， Qingdao 266300， China

[Abstract] Objective To investigate effect of putative receptor protein related to the angiotensin receptor AT1 （APJ） antagonist Apelin13 （F13A） on the polarization of tumor-associated macrophages （TAM） and the invasion induced by M2 type macrophages in breast cancer cells line MCF-7 cells. Methods Macrophage RAW264.7 cells were treated with IL-13 （10 ng/mL） for 24 h to induce M2 type polarization （M2RAW） and the cells were treated with Apelin-13（F13A） （10.00 pm/mL） for 24 h. RAW and MCF-7 cells were co-cultured for 48 h in non-contact manner. The proliferation of RAW and MCF-7 was detected by MTT. Levels of transforming growth factor-β （TGF-β） and interleukin-10 （IL-10） in culture medium were tested by ELISA. Expression of marker protein of M2 type polarization arginase 1 （Arg-1） were measured by Western blot. Migration and invasiveness of MCF-7 cells were tested by scratch test and Transwell method. Results Compared with RAW group， levels of TGF-β and IL-10 and expression of Arg-1 in M2RAW group were significantly increased， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Compared with M2RAW group， levels of TGF-β and IL-10 and expression of Arg-1 in M2RAW+Apelin-13 （F13A） group were significantly decreased， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Compared with RAW+MCF-7 group， scratch area was significantly decreased， the number of cell through the membrane was significantly increased in M2RAW+MCF-7 group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Compared with M2RAW+MCF-7 group， scratch area was significantly increased， the number of cell through the membrane was significantly decreased in Apelin-13（F13A）+M2RAW+MCF-7 group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion Apelin13 （F13A） inhibits the polarization of tumor related macrophages and the invasion induced by M2 type macrophages in breast cancer cells line MCF-7 cells.

[Key words] Putative receptor protein related to the angiotensin receptor AT1； Antagonists； Mammary cancer； Tumor invasion； Tumor-associated macrophages； M2 type polarization

乳腺癌是常見的女性惡性腫瘤，全球患者每年高達20萬[1]。血管緊張素受體AT1相關(guān)的受體（putative receptor protein related to the angiotensin receptor AT1，APJ）是屬于G蛋白偶聯(lián)受體，Apelin是其天然配體[2]。Apelin/APJ系統(tǒng)與乳腺癌、口腔癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤等的發(fā)生密切相關(guān)[3-4]。Apelin和APJ在多種腫瘤中的表達上調(diào)，APJ激活可促進腫瘤細胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移[5-6]。Apelin13（F13A）是Apelin-13的類似物，能與APJ結(jié)合，不能激活A(yù)PJ，是APJ阻斷劑。腫瘤相關(guān)巨噬細胞（tumor-associated macrophages，TAM）是在腫瘤組織中分布具有抗炎功能的巨噬細胞，TAM不同的極化表型與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[7-8]。因此2017年7～12月，筆者通過實驗觀察Apelin13（F13A）對巨噬細胞極化及其誘導(dǎo)的乳腺癌細胞系MCF-7細胞遷移和侵襲的影響，旨在為乳腺癌的防治提供新的靶點和策略。

1 材料與方法

1.1 材料

MCF-7細胞（中國科學(xué)院細胞研究所），RAW 264.7細胞（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細胞中心）。Apelin 13（F13A）（Sigma）。胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），DMEM培養(yǎng)基（Gibco）。轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）和白細胞介素-10（interleukin10，IL-10）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。山羊抗鼠精氨酸酶-1（Arginase-1，Arg-1）抗體和二抗（Santa Cruz）。SM600多功能酶標儀（上海永創(chuàng)醫(yī)療器械有限公司），垂直電泳儀與轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（Hoefer公司），凝膠成像分析系統(tǒng)（北京六一生物科技有限公司），圖像分析系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 MCF-7和RAW264.7細胞的培養(yǎng)與實驗分組 MCF-7和RAW264.7細胞用DMEM培養(yǎng)液（10%胎牛血清）培養(yǎng)在37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中。0.25%胰蛋白酶消化和傳代，取對數(shù)生長期、融合度達80%左右的細胞用于實驗。

實驗分為以下組：RAW264.7組（RAW）：含DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h；M2型RAW264.7組（M2RAW）：用IL-13（10 ng/mL）處理RAW 24 h；Apelin-13（F13A）組：用Apelin-13（F13A）（10.00 pm/mL）孵育RAW 24 h；M2型RAW264.7+Apelin-13（F13A）（M2RAW+Apelin-13（F13A））：用IL-13（10 ng/mL）和Apelin-13（F13A）（10.00 pm/mL）共處理24 h；MCF-7組（MCF-7）：DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h；RAW264.7+MCF-7組（RAW+MCF-7）：DMEM培養(yǎng)基非接觸共培養(yǎng)48 h；M2型RAW264.7+MCF-7組（M2RAW+MCF-7）：先用IL-13（10 ng/mL）處理24 h，再與MCF-7在非接觸共培養(yǎng)48 h；Apelin-13（F13A）+RAW264.7+MCF-7組（Apelin-13（F13A）+RAW+MCF-7）：先用Apelin-13（F13A）（10.00 pm/mL）處理RAW 24 h，再與MCF-7非接觸共培養(yǎng)48 h；Apelin-13（F13A）+M2型RAW 264.7+MCF-7組（Apelin-13（F13A）+M2RAW+MCF-7）：先用IL-13（10 ng/mL）和Apelin-13（F13A）（10.00 pm/mL）共同處理RAW 24 h，換培養(yǎng)，再與MCF-7非接觸共培養(yǎng)48 h；

1.2.2 ELISA檢測 各組處理結(jié)束后，收集細胞培養(yǎng)液上清，采用ELISA法檢測培養(yǎng)液上清中TNF-α和IFN-γ的水平。按說明書進行操作，BCA法定量培養(yǎng)液上清中總蛋白水平，結(jié)果用“ng/g蛋白”表示。

1.2.3 Western blot分析 處理結(jié)束后，收集細胞，提取細胞總蛋白，BCA法定量蛋白濃度。取適量蛋白樣本，在上樣緩沖液中煮沸10 min。冷卻后SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上，電流強度為80～100 mA，時間為1 h。麗春紅染色，觀察蛋白轉(zhuǎn)移效果，確定蛋白分子量標準位置。5%脫脂牛奶室溫下孵育聚偏氟乙烯膜2 h。加入山羊抗鼠Arg-1和β-actin的相應(yīng)一抗，4℃過夜。洗膜3次，加入二抗，4℃下孵育4 h。蛋白質(zhì)印跡熒光檢測試劑盒曝光于X線，顯影、暗室曝光，采用凝膠圖像分析系統(tǒng)對膠片掃描，結(jié)果以目的蛋白和β-actin灰度比值表示進行半定量分析。

1.2.4 MTT法檢測細胞活力 RAW細胞制成細胞懸液（2×105/mL）接種于半透膜孔徑為0.4 μm的Transwell上室中。RAW264.7細胞貼壁后將Transwell放置在預(yù)先接種了MCF-7的24孔板中，構(gòu)建非接觸共培養(yǎng)體系，37℃、5%CO2孵育48 h。取出Transwell小室，每孔加入100 μL MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h。每孔加入100 μL DMSO，振蕩，酶標儀上測定波長為490 nm的吸光度（OD）值。計算細胞存活率：存活率（%）=處理組OD值/對照組OD值×100%。

1.2.5 劃痕實驗 MCF-7細胞，制成細胞懸液（1×105個細胞/孔）接種6孔培養(yǎng)板。將RAW細胞接種在Transwell上室，Transwell置于6孔培養(yǎng)板中，MCF-7生長融合至90%時，移除上室，100 μL移液器槍頭垂直劃，PBS洗2次。繼續(xù)共培養(yǎng)48 h，倒置顯微鏡觀察劃痕中細胞的轉(zhuǎn)移，拍照記錄，圖像分析軟件測量劃痕寬度，計算劃痕愈合率=[（0 h劃痕面積-48 h劃痕面積）/0 h劃痕面積×100%]。

1.2.6 Transwell實驗 RAW細胞（1×105個細胞/孔）接種于24孔板中。孔徑為8.0 μm半透膜置于Transwell上室底部，加入基質(zhì)膠，固化。MCF-7制成細胞懸液，接種于Transwell上室（5×105個細胞/孔），Transwell置于預(yù)接種了RAW的24孔板孔中，非接觸共培養(yǎng)體48 h。移出上室，4%多聚甲醛固定，加入0.1%結(jié)晶紫溶液，染色20 min。在高倍鏡（×200）下隨機取3個視野計數(shù)轉(zhuǎn)移細胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義

2 結(jié)果

2.1 IL-13和Apelin-13（F13A）對RAW細胞活力的影響

M2RAW組（105.34±5.67）、Apelin-13（F13A）組（99.73±6.18）和M2RAW+Apelin-13（F13A）組（102.85±7.49）的細胞存活率與RAW組（100.00±0.00）比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見圖1。

2.2 Apelin-13（F13A）抑制RAW264.7細胞的M2型極化

與RAW組（100.00±0.00）比較，M2RAW組TGF-β[（15.46±1.43）ng/g蛋白vs.（36.84±2.55 ng/g）蛋白）]和IL-10[（13.76±1.15）ng/g蛋白vs.（31.49±3.12）ng/g蛋白）]水平顯著增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；與M2RAW組比較，M2RAW+Apelin-13（F13A）組TGF-β[（6.84±2.55）ng/g蛋白vs.（18.21±2.13）ng/g蛋白）]和IL-10[（31.49±3.12）ng/g蛋白vs.（15.71±1.81）ng/g蛋白）]水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見圖2。

進一步檢測RAW264.7細胞中M2型極化標志蛋白Arg-1的水平，與RAW組（0.21±0.03）比較，M2RAW組（1.13±0.09）細胞中Arg-1的表達顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；與M2RAW組（1.13±0.09）比較，M2RAW+Apelin-13（F13A）組（0.31±0.04）細胞中Arg-1的表達顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見圖3。

2.3 RAW巨噬細胞對MCF-7細胞活力的影響

RAW+MCF-7組[104.59±6.71）%]、M2RAW+MCF-7組[（104.72±8.46）%]、Apelin-13（F13A）+RAW+MCF-7組[（102.37±11.26）%]、Apelin-13（F13A）+M2RAW+MCF-7組[（103.53±7.31）%]的細胞存活率與MCF-7組[（100.00±0.00）%]比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見圖4。

2.4 Apelin-13（F13A）抑制巨噬細胞M2型極化而抑制其誘導(dǎo)的MCF-7細胞遷移和侵襲

與RAW+MCF-7組[（94.76±8.73）%]比較，M2RAW+MCF-7組[（38.87±5.44）%]MCF-7的運動遷移速度明顯增加，細胞劃痕顯著減小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；與M2RAW+MCF-7組[（38.87±5.44）%]，Apelin-13[（F13A）+M2RAW+MCF-7組[（86.56±8.97）%]MCF-7的運動遷移速度明顯減慢，細胞劃痕顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見圖5。

與RAW+MCF-7組[（513.36±45.67）個/視野]比較，M2RAW+MCF-7組[（1145.66±87.39）個/視野]破壞基質(zhì)膠侵襲的MCF-7細胞數(shù)明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；與M2RAW+MCF-7組[（1145.66±87.39）個/視野]，Apelin-13（F13A）+M2RAW+MCF-7組[（675.35±57.96）個/視野]破壞基質(zhì)膠侵襲的MCF-7細胞數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見圖6。

3 討論

乳腺癌是女性因癌癥死亡的首要原因，嚴重威脅著女性的健康[9-10]。盡管乳腺癌的治療手段已取得了很大進步，但是整體上來說乳腺癌的預(yù)后仍然較差，手術(shù)后5年復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率較高[11-12]。乳腺癌治療失敗的主要原因是腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，因此探索新的抑制乳腺癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移侵襲的有效治療方法是目前乳腺癌研究領(lǐng)域的熱點課題。本研究的結(jié)果顯示APJ受體的拮抗劑Apelin13（F13A）可抑制巨噬細胞M2型極化，同時抑制了M2型極化巨噬細胞誘導(dǎo)的乳腺癌細胞遷移和侵襲。

Apelin是APJ在機體內(nèi)的天然配體，Apelin和APJ在肺癌、乳腺癌和子宮癌等中高表達[13-14]。APJ抑制劑能有效抑制血管新生，抑制腫瘤細胞的增殖，已經(jīng)成為腫瘤治療的新靶點[15-16]。Apelin-13（F13A）是同Apelin-13具有相似化學(xué)結(jié)構(gòu)的一種相似物，Apelin-13（F13A）同樣具有與APJ受體結(jié)合的能力，但不能激活A(yù)PJ受體，被認為是APJ的拮抗劑[17]。

TAM是實體腫瘤組織中主要的基質(zhì)細胞，TAM是腫瘤微環(huán)境中的一類具有很強的可塑性和功能異質(zhì)性的細胞[18-19]。TAM有經(jīng)典活化（M1型）和替代活化（M2型）兩種極化類型。M1型TAM具有遞呈抗原和促進炎性反應(yīng)的作用，腫瘤細胞具有殺傷作用。M2型TAM具有抑制炎癥、促進組織修復(fù)、腫瘤組織內(nèi)血管新生和促進腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移等作用[20]。本研究中觀察了Apelin-13（F13A）阻斷APJ系統(tǒng)對巨噬細胞極化狀態(tài)的影響，結(jié)果顯示Apelin-13（F13A）抑制了IL-13誘導(dǎo)的M2型極化。由于M2型極化的TAM可以促進腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，因此建立RAW264.7細胞與乳腺癌細胞系MCF-7細胞的非接觸共培養(yǎng)體系，檢測MCF-7的侵襲轉(zhuǎn)移能力。結(jié)果表明Apelin-13（F13A）抑制IL-13誘導(dǎo)的M2型極化，也抑制了M2型TAM誘導(dǎo)的乳腺癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，提示Apelin-13（F13A）可能是乳腺癌治療的一個新的有效的途徑。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)Apelin13（F13A）抑制巨噬細胞M2型極化，從而抑制了M2型極化的巨噬細胞誘導(dǎo)的乳腺癌細胞遷移和侵襲。本研究為乳腺癌的防治提供了新的線索和途徑。

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（收稿日期：2018-01-31 本文編輯：任 念）