張建榮 / 通標標準技術(shù)服務(wù)上海有限公司

0 引言

日常生活中，人們所食用的動物性食品，包括動物肌肉（豬、牛、雞肉）、動物肝臟、脂肪、雞蛋等，當然也包括牛奶和各種奶制品（奶粉、奶酪、奶油等），都是含有微量激素的食品。這些食品中所含雌激素主要是內(nèi)源性雌激素，主要包括雌酮、β-雌二醇、雌三醇，其中β-雌二醇的活性最強，對其檢測具有一定的代表性；另外還可能有人為添加的，屬于人工合成的外源性雌激素，最具代表性的是二苯乙烯類合成雌激素，主要有己烯雌酚，己二烯雌酚，己烷雌酚等，它們可以進入動物體內(nèi)，通過干擾動物體內(nèi)源性雌激素的合成、分泌、轉(zhuǎn)運、結(jié)合、活性反應(yīng)、代謝、消解或產(chǎn)生類似生物體內(nèi)源性雌激素的作用[1]。

由于有人將雌激素用于養(yǎng)殖業(yè)以促進動物生長，如果人們長期食用這種激素含量較高的動物產(chǎn)品，會導(dǎo)致產(chǎn)生諸如兒童性早熟、成年人癌癥等負面影響，因此應(yīng)嚴格控制食品中雌激素的含量[2]。

而己烷雌酚、己烯雌酚、雙烯雌酚都屬于人工合成的雌性激素，是1，2-二苯乙烯類化合物，具有促進動物生長的特性。它能促進動物體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成代謝，提高動物日增重量，提高飼料效率。因此，其一直作為生長促進劑用在豬、羊、牛、雞等畜禽的飼養(yǎng)過程中。但現(xiàn)已證實這些人工合成的雌性激素可在動物的肝臟、肌肉中殘留，從而能誘發(fā)動物和人的白血病、子宮癌等疾病[3]。因此，早在1988年1月1日歐盟就發(fā)出了禁止使用促生長人工合成激素，并對其按殘留指令（86/469/EEC）實行監(jiān)控。人工合成激素在歐、美等國家已被禁用。我國農(nóng)業(yè)部也于1988年6月30日發(fā)布了《獸藥管理條例實施細則》，并于1998年進行了修訂。然而，由于后來發(fā)現(xiàn)的多種可促進動物生長的代用物的效力都遠不如己烯雌酚，以致使己烷雌酚、己烯雌酚、雙烯雌酚特別是己烯雌酚等人工合成的雌性激素在動物生產(chǎn)過程中的使用禁而不止。因此建立準確可靠的動物源性食品中雌激素殘留檢測方法至關(guān)重要[4]。

目前動物源食品中雌激素殘留的檢測，最廣泛使用的是氣相色譜法、液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、免疫分析法、生物傳感器法等[2]。由于動物性食品中雌激素殘留物水平很低，樣品基質(zhì)復(fù)雜，干擾物質(zhì)多，所以對于殘留分析技術(shù)的要求甚高。通過文獻查找發(fā)現(xiàn)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對復(fù)雜基體中微量待測物的測定比較有效。質(zhì)譜分析的基本原理是使所研究的混合物或單體形成離子，然后使形成的離子按質(zhì)量，確切地講按質(zhì)荷比M/Z進行分離。質(zhì)譜檢測器可以檢測多種樣品，且具有高靈敏度，可以獲得不同于常規(guī)HPLC檢測器的大量而豐富的結(jié)構(gòu)信息。然而，盡管質(zhì)譜常?？梢缘玫交衔锓肿与x子及碎片的信息，但混合物的質(zhì)譜解析往往難以實現(xiàn)。液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用，可以首先將混合物分離為單一組分，之后再用質(zhì)譜檢測器進行檢測。如此過程不僅可以得到更有意義的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，而且可以在一定程度上排除基質(zhì)干擾，克服離子抑制現(xiàn)象，優(yōu)化質(zhì)譜檢測信號[5]。

因此，本文將采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法來測定激素殘留量，這種試驗方法準確度高,重現(xiàn)性好，操作快速簡便，一般可以滿足動物源食品中測定激素殘留量的需要。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

1.1.1 串聯(lián)四級桿液質(zhì)聯(lián)用儀：ABI API4000（配備ESI源）、Agilent 1200液相色譜系統(tǒng)：液相系統(tǒng)包括自動進樣器和四元梯度泵。軟件使用Analyst 1.4.1版。

1.2 試劑

1.2.1 溶液

1）0.2 mol/L醋酸銨緩沖液（pH 5.2±0.2）：15.4 g 醋酸銨溶解于900 mL水中，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH，使其至pH 5.2 ±0.2 ，用水定容至1 L，有效期為3個月。

2）β-葡糖醛酸糖醛酸酶/芳香基硫酸酯酶（β-glucuronidase/arylsulfatase）：4.5 U/mL β- 葡 糖 醛酸糖醛酸酶，14 U/mL芳香基硫酸酯酶[5]。

3）洗脫液： 取70 mL二氯甲烷加30 mL甲醇，混勻。

4）定容液：乙腈∶水（1∶1），溶解混勻。

5）己烷雌酚、己烯雌酚、雙烯雌酚、雌二醇和雌酮單標標準儲備液（1.0 mg/mL）：分別準確稱取10.0 mg標準品于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配成1.0 mg/mL的標準儲備液。根據(jù)需要再用甲醇將標準儲備液稀釋成適當濃度的標準工作溶液[5]。

6）己烯雌酚-d8、雌二醇-13C2單標內(nèi)標儲備液（1.0 mg/mL）：準確稱取10.0 mg同位素標準品于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配成1.0 mg/mL的標準儲備液。根據(jù)需要再用甲醇將標準儲備液稀釋成適當濃度的標準工作溶液。

7）己烷雌酚、己烯雌酚、雙烯雌酚、雌二醇和雌酮單標標準工作液（1.0 μg/mL）：分別取1.0 mg/mL的單標標準儲備液10 μL，稀釋定容至10 mL，于-4 ℃下低溫保存[5]。

8）己烯雌酚-d8、雌二醇-13C2單標內(nèi)標工作液（1.0 μg/mL）：取1.0 mg/mL的單標內(nèi)標標準儲備液10 μL，稀釋定容至10 mL，于-4 ℃下低溫保存[5]。

1.3 實驗方法

1.3.1 稱樣酶解

各稱取5 g樣品（準確至0.01 g）于50 mL 具蓋離心管中，加入10 mL醋酸銨緩沖溶液（pH 5.2，0.02 moL/L），再加入25 μL酶液，漩渦混勻，于37 ℃恒溫水溫箱過夜，振蕩酶解12 h。

1.3.2 提取

將上述樣品取出放置至室溫后，分別加入20 μL內(nèi)標工作溶液，再加入30 mL乙腈提取液，振蕩提取5 min。于4 500 r/min離心5 min，吸取上清液于250 mL的梨形瓶中。

1.3.3 濃縮

打開旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，設(shè)置轉(zhuǎn)速115 r/min，水溫40 ℃，壓強90 mPa，去除乙腈近2 mL后，加10 mL蒸餾水，渦旋振蕩，溶液待凈化。

1.3.4 固相萃取凈化

活化：用6 mL二氯甲烷∶甲醇（7∶3，體積比）、6 mL甲醇、6 mL水活化ENVI-CARB固相萃取柱（500 mg/6 mL）。

用6 mL二氯甲烷∶甲醇（7∶3，體積比）活化氨基柱。

上樣：提取液以1滴/s的速度從ENVI-CARB柱流出。

淋洗：先用3 mL水淋洗，減壓抽干；后用3 mL正己烷淋洗，抽干，將雜質(zhì)去除。

洗脫：將活化好的氨基柱串接在ENVI-CARB固相萃取柱下方，用6 mL的二氯甲烷∶甲醇（7∶3，體積比）洗脫，去掉ENVI-CARB柱，再用3 mL的二氯甲烷∶甲醇（7∶3，體積比）洗脫氨基柱，收集洗脫液。

1.3.5 濃縮

將收集完的洗脫液在40 ℃水溫、微弱的氮氣流下吹干。

1.3.6 定容

用1 mL乙腈∶水（1∶1）溶解殘渣，渦旋振蕩1 min，再用1 mL針筒吸取溶解液，過有機相濾膜，裝入進樣小瓶中，供液質(zhì)聯(lián)用儀器測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理

本實驗采用了β-葡糖醛酸糖醛酸酶酶解樣品，達到了將動物組織中蛋白質(zhì)消解，使被測物從細胞中的蛋白質(zhì)結(jié)合狀態(tài)下（非共價蛋白質(zhì)鍵合物）游離出來的目的。

另外在提取過程中，通過反復(fù)試驗，最終采取乙腈作為提取液，而非一般所用的甲醇提取液。這是因為乳與乳制品中蛋白較多，如果提取過程中不能將大量蛋白去除，將在凈化過程中引起固相萃取小柱的堵塞，由于乙腈溶液沉淀蛋白質(zhì)的效果要優(yōu)于甲醇，因此采用乙腈提取可獲得滿意的效果。

本文正是通過對不同基質(zhì)的樣品的加標回收來驗證采用β-葡糖醛酸糖醛酸酶酶解樣品和使用乙腈作為提取液的方法的顯著優(yōu)越性。

由于樣品的基質(zhì)抑制效應(yīng)非常明顯，因此樣品的凈化步驟非常重要，樣品凈化程度好可大大提高檢測的靈敏度。通過本方法的驗證,本實驗所采用的凈化方式能提供一個可靠的凈化效果。

2.2 檢測手段的選擇

一般選擇氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，只能分離分析極性小和對熱穩(wěn)定的化合物，而液相色譜法在通用性和靈敏度上不如液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，其他方法有的試劑用量多，有的操作復(fù)雜、花費時間長，有的不宜準確定量[6]。

而液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)解決了傳統(tǒng)液相檢測器靈敏度和選擇性不夠的缺點, 對復(fù)雜基體中微量待測物進行測定，可以做到在復(fù)雜樣本體系中進行目標化合物的快速定量,而且簡化了試驗步驟, 大大節(jié)省了工作量，提高了效率, 特別適合于親水性強、揮發(fā)性強的有機物, 熱不穩(wěn)定化合物及生物大分子的分離分析。同時該檢測方法的靈敏度與精密度均符合對雌激素殘留檢測的需求[7][8]。

在分析過程中發(fā)現(xiàn)，合成苯二烯類合成雌激素的響應(yīng)值較高，而雌二醇的響應(yīng)值最低，如果流動相只用乙腈和水，則雌二醇的最低檢出限很難達到1 μg/kg。由于分析雌激素的質(zhì)譜電離模式采用的是負模式，因此向流動相中添加適量的氨水，以促進化合物的離子化，從而達到了理想的豐度。

2.3 儀器參數(shù)的優(yōu)化

2.3.1 液相色譜測定條件[9]

色譜柱：CNW Athena C18-WP 2.1 mm×150 mm，5 μm；流動相：A：水，B：乙腈+0.1% 氨水（加入氨水可促進離子化）；洗脫梯度：見表1；流速：0.3 mL/min；進樣體積：30 μL。

表1 雌激素梯度洗脫條件

2.3.2 質(zhì)譜測定條件

電離化方式：電噴霧離子化（ESI）；掃描方式：負離子掃描；監(jiān)測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；離子源溫度 ：450 ℃；霧化氣壓強：60× 6.894 757 kPa；氣簾氣壓強：30× 6.894 757 kPa；輔助氣壓強：60×6.894 757 kPa；電噴霧電壓：-4 500 V；定性離子對、定量離子對、碰撞氣能量和去簇電壓，見表2。

表2 目標物的母離子、子離子及EP、DP、CE、CXP電壓值

2.4 方法的線性回歸曲線方程

根據(jù)上述實驗條件，將己烷雌酚、己烯雌酚、雙烯雌酚、雌二醇和雌酮標準溶液系列等體積進樣，以目標物峰面積乘內(nèi)標物濃度和內(nèi)標的峰面積比值為縱坐標，以目標物濃度為橫坐標，繪制標準曲線，并計算相關(guān)系數(shù)。每個化合物的曲線方程及相關(guān)系數(shù)見表3，得到可接受的標準曲線相關(guān)系數(shù)的最低值為0.99。

表3 化合物的曲線方程及相關(guān)系數(shù)

2.5 方法的回收率和精密度

以不含雌二醇、雌酮、己烷雌酚、己烯雌酚、雙烯雌酚和雌酮的牛奶、奶酪、煉乳、奶粉為空白樣品，分別按1.0、2.0、5.0 μg/kg三個水平做添加回收實驗和精密度實驗，每種基質(zhì)每個水平做6個平行實驗，其回收率和精密度數(shù)據(jù)見表4～7。

表4 牛奶

表5 奶酪

從表4～7中看到，目標物的回收率及精密度結(jié)果均能夠滿足殘留分析檢測的需求。本實驗的測定低限均為1 μg/kg。在線性范圍內(nèi)可接受的回收率平均范圍為60%～105%，精密度（相對標準偏差）為≤20%。其中雌二醇回收率范圍在68.0%～102.0%，相對標準偏差在2.9%～14.3%；己烷雌酚的回收率范圍在67.5%～104.4%，相對標準偏差在6.42%～12.3%；己烯雌酚回收率范圍在59.2%～105.0%，相對標準偏差在5.07%～16.3%；雙烯雌酚的回收率范圍在67.4%～105.0%，相對標準偏差在3.72%～14.2%；雌酮的回收率范圍在67.4%～104.4%，相對標準偏差在3.72%～16.3%。

表6 煉乳

表7 奶粉

2.6 定性測定

每種被測組分選擇1個母離子，2個以上子離子。在相同實驗條件下，樣品中待測物質(zhì)保留時間，與混合標準溶液中對應(yīng)的相對保留時間偏差在±2.5%之內(nèi)，各目標物的保留時間為雌二醇（5.22 min）、己烷雌酚（6.04 min）、己烯雌酚（6.36 min）、雙烯雌酚（6.49 min）、雌酮（3.71 min）；與樣品譜圖中各組分定性離子的相對豐度進行比較，若偏差不超過表5規(guī)定的范圍，則可判定為樣品中存在對應(yīng)的待測物。

表5 定性確證時相對離子豐度的最大允許偏差/%

2.7 定量測定

在最佳工作條件下，混合標準溶液分別進樣，以工作溶液濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準工作曲線。采用內(nèi)標法進行定量測定，由于樣品的基質(zhì)抑制效應(yīng)非常明顯，因此同位素內(nèi)標方法是非常好的校正方法。其作用在于可監(jiān)測回收率、作為保留時間校正物或色譜參考物[10]。其中雌二醇以雌二醇同位素內(nèi)標，其他三個外源性激素以己烯雌酚同位素為內(nèi)標。樣品溶液中待測物的響應(yīng)值應(yīng)在工作曲線范圍內(nèi)。

2.8 結(jié)果計算

如樣品中含有雌二醇、己烷雌酚、己烯雌酚、雙烯雌酚、雌酮，即滿足定性標準條件，可用數(shù)據(jù)處理機，或按式（1）計算試樣中待測物的含量：

式中：Xi—— 試樣中目標物的含量，μg/kg；

c—— 從標準曲線得到的目標物溶液濃度，ng/mL；

V—— 樣液最終定容體積， mL；

m—— 最終樣液所代表的量，g

3 結(jié)語

本實驗結(jié)合液相色譜與質(zhì)譜檢測器聯(lián)用技術(shù)的特點，建立了有效的LC-MS/MS測定乳與乳制品中雌激素殘留量的方法。通過前處理將樣品濃縮提純，從而使檢測靈敏度提高，減小了干擾峰對目標峰的影響。經(jīng)過前處理的樣品在檢測器最佳色譜條件下對食品中殘留的雌二醇、己烯雌酚、雙烯雌酚、己烷雌酚、雌酮進行測定。經(jīng)實驗分析，該方法線性關(guān)系良好，最小檢出濃度、回收率及精密度等均符合標準方法的研制要求，因此本方法可行性較強，便于推廣使用。