足細(xì)胞是位于腎小球基膜外表面的終末分化細(xì)胞，在保持腎小球過(guò)濾屏障的結(jié)構(gòu)和功能方面起關(guān)鍵作用。足細(xì)胞基因表達(dá)譜為足細(xì)胞研究提供了重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支撐，分析比較正常和疾病狀態(tài)下足細(xì)胞mRNA表達(dá)譜可提示參與疾病發(fā)生和進(jìn)展的基因。研究人員通過(guò)計(jì)算機(jī)學(xué)習(xí)分析、分離足細(xì)胞或進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序，建立了足細(xì)胞特異性基因表達(dá)譜，為研究生理及病理狀態(tài)下足細(xì)胞功能奠定了分子基礎(chǔ)。

1998年，研究者利用定位克隆技術(shù)，發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞裂孔隔膜相關(guān)分子NPHS1基因突變可導(dǎo)致先天性芬蘭型腎病綜合征，研究者開(kāi)始意識(shí)到足細(xì)胞損傷可能是導(dǎo)致蛋白尿的始動(dòng)環(huán)節(jié)。近年來(lái)，通過(guò)對(duì)先天性和遺傳性腎病綜合征家系研究，先后確定四十多個(gè)足細(xì)胞分子基因突變，極大加深了對(duì)足細(xì)胞在腎小球功能中重要作用的認(rèn)識(shí)。同時(shí)，非編碼RNA、免疫因素和腎小球固有細(xì)胞相互影響在足細(xì)胞功能和損傷中的作用被發(fā)現(xiàn)和研究。

足細(xì)胞相關(guān)疾病基因組學(xué)研究

通過(guò)對(duì)先天性和遺傳性腎病綜合征家系研究，腎小球?yàn)V過(guò)屏障功能障礙或致蛋白尿相關(guān)的基因不斷被發(fā)現(xiàn)，目前已證實(shí)四十多個(gè)導(dǎo)致遺傳性腎病綜合征的單基因突變[1]。這些基因編碼蛋白大都位于足細(xì)胞上(圖1)，參與足細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，如二酰甘油激酶(ethylene diamine tetraacetic acid，DGKE)基因和磷脂酶Cε1(PLCE1)，穩(wěn)定骨架結(jié)構(gòu)等功能，從遺傳學(xué)角度證實(shí)了足細(xì)胞在濾過(guò)屏障中的重要作用。斑馬魚模型在上述突變基因功能篩選中發(fā)揮了重要作用[2-5]。

圖1 遺傳性腎病綜合征的突變基因及其致病通路

通過(guò)全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome-wide association study，GWAS)相繼發(fā)現(xiàn)APOL1和MYH9基因單核苷酸多態(tài)性(SNPs)與非洲裔美國(guó)人的局灶性節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)的高發(fā)病率有關(guān)[6]。Xie等[7]通過(guò)對(duì)FSGS 家系進(jìn)行連鎖分析，發(fā)現(xiàn)染色體14q32倒置形成蛋白2(inverted formin 2，INF2)2號(hào)外顯子存在堿基變異m.253C>G，其所編碼的85位氨基酸由絲氨酸改變?yōu)樯彼?p.S85W)；中國(guó)家族性FSGS中INF2突變的總體頻率約3.6%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于歐洲FSGS家族的頻率。Gbadegesin等[8]應(yīng)用外顯子芯片分析了南亞214例激素敏感性腎病綜合征(SSNS)兒童患者的外顯子組，發(fā)現(xiàn)位于6號(hào)染色體的主要組織相容性復(fù)合物(MHC)II類基因HLA-DQA1和HLA-DQB1區(qū)域的SNPs，與激素敏感性腎病綜合征關(guān)聯(lián)，提示免疫因素參與激素敏感性腎病綜合征發(fā)病機(jī)制。

HLA基因異常還與膜性腎病(MN)發(fā)病機(jī)制相關(guān)，Stanescu等[9]對(duì)556例特發(fā)性膜性腎病(IMV)的白種人進(jìn)行了全基因組關(guān)聯(lián)研究，發(fā)現(xiàn)位于染色體2q24編碼M型磷脂酶A2受體(PLA2R)基因(SNP rs4664308)和6p21編碼HLA-DQA1基因(SNP rs2187668)的SNPs位點(diǎn)，與IMN有密切關(guān)聯(lián)。同時(shí)攜帶這兩個(gè)風(fēng)險(xiǎn)等位基因者，IMN的可能性高達(dá)78.5%，推測(cè)攜帶HLA-DQA1 SNP rs2187668等位基因可能促進(jìn)機(jī)體針對(duì)靶抗原，如PLA2R1突變體的自身免疫應(yīng)答。

HLA等位基因HLA-DRB1*15∶ 01 和 HLA-DRB3*02∶ 02與中國(guó)人群PLA2R 相關(guān)MN顯著相關(guān)。在249例病例對(duì)照研究中(99 例 PLA2R陽(yáng)性的MN患者、50 例 PLA2R 陰性MN患者及100例正常人)，Le等[10]發(fā)現(xiàn)HLA-DRB1*15∶ 01和HLA-DRB3*02∶ 02為PLA2R相關(guān)MN風(fēng)險(xiǎn)等位基因，無(wú)其他HLA等位基因與PLA2R相關(guān)MN顯著相關(guān)。含293例PLA2R相關(guān)的MN患者和 285健康對(duì)照者的獨(dú)立的隊(duì)列研究驗(yàn)證了這一發(fā)現(xiàn)，98.7% PLA2R相關(guān)的MN患者攜帶至少一個(gè)HLA風(fēng)險(xiǎn)等位基因，其中72.2%患者攜帶HLA-DRB1*15∶ 01等位基因，69.9%患者攜帶HLA-DRB3*02∶ 02等位基因。多因素logistic回歸模型評(píng)價(jià)單個(gè)SNP與遺傳風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分之間的關(guān)聯(lián)性，顯示 HLA-DRB1*15∶ 01(OR 24.9；95%CI 15.3～42.6；P=2.3×10-35)和 HLA-DRB3*02∶ 02(OR 17.7；95%CI 11.0～30.3；P=8.0×10-29)相互獨(dú)立地與PLA2R相關(guān)膜性腎病密切相關(guān)。

足細(xì)胞基因表達(dá)譜研究

獲得正常和疾病狀態(tài)下足細(xì)胞特異性基因轉(zhuǎn)錄譜，對(duì)于開(kāi)展足細(xì)胞功能維系和足細(xì)胞損傷分子機(jī)制的研究至關(guān)重要。在成功分離足細(xì)胞之前，研究人員多是通過(guò)微分離腎小球獲得腎小球轉(zhuǎn)錄組，但腎小球中還包含血管內(nèi)皮細(xì)胞和系膜細(xì)胞，多種細(xì)胞來(lái)源的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)不能代表足細(xì)胞特異性基因表達(dá)譜。

Fu等[11]利用腎小球足細(xì)胞特異性表達(dá)綠色熒光蛋白標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因小鼠，構(gòu)建糖尿病腎病模型(STZ-eNOS-/-)后，流式細(xì)胞儀分選足細(xì)胞后進(jìn)行基因表達(dá)譜分析，相較于正常對(duì)照小鼠，DN小鼠足細(xì)胞表達(dá)譜中上調(diào)的基因主要參與微管形成、細(xì)胞遷移和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等骨架結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)通路，下調(diào)的基因參與RNA加工和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能調(diào)節(jié)，提示糖尿病狀態(tài)下足細(xì)胞mTOR通路和自噬/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的改變。

Ju等[12]應(yīng)用計(jì)算機(jī)模擬分析方法，分離和鑒定特定細(xì)胞類型的基因表達(dá)。該方法利用迭代分類算法和機(jī)器學(xué)習(xí)算法，基于大量的腎小球轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)確定足細(xì)胞特異性的轉(zhuǎn)錄本。將已知的46個(gè)足細(xì)胞標(biāo)記基因(如ACTN4，NPHS1，NPHS2，SYNPO，PTPRO等)作為陽(yáng)性對(duì)照，48個(gè)足細(xì)胞不表達(dá)的基因(ACTA2，ADAM10，AGTR1，ALDOB，ALOX1等)作為陰性對(duì)照，為計(jì)算機(jī)提供標(biāo)準(zhǔn)的統(tǒng)計(jì)評(píng)分和細(xì)化標(biāo)準(zhǔn)，不斷提煉預(yù)測(cè)足細(xì)胞特異性表達(dá)模式和信息條件，在全基因組水平上對(duì)細(xì)胞特異性基因進(jìn)行高精度預(yù)測(cè)。將這種策略應(yīng)用于顯微切割獲得的452個(gè)人腎小球微陣列數(shù)據(jù)集，預(yù)測(cè)了136個(gè)新的足細(xì)胞富集表達(dá)基因，結(jié)合人類蛋白質(zhì)圖集(human protein atlas，HPA)的免疫組化結(jié)果，確定了特異性表達(dá)于足細(xì)胞的基因，如PCOLCE2，PLA2R1，F(xiàn)GF1，PRKAR2B等。

通過(guò)熒光標(biāo)記獲得足細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序或芯片分析基因表達(dá)譜的策略，難以應(yīng)用于臨床患者。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組是在單個(gè)細(xì)胞水平進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析的一項(xiàng)新技術(shù)。Lu等[13]通過(guò)腎小球單細(xì)胞測(cè)序，鑒定出足細(xì)胞表達(dá)基因群，并通過(guò)體外細(xì)胞基因干擾研究確定了其中參與維持足細(xì)胞骨架穩(wěn)定的一批重要基因。研究人員通過(guò)磁珠法分離腎小球，酶解后獲得單細(xì)胞，通過(guò)qPCR檢測(cè)足細(xì)胞特異性表達(dá)基因podocin、synaptopodin和Wilms腫瘤蛋白(WT1)，篩選出20個(gè)足細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序。研究發(fā)現(xiàn)20個(gè)足細(xì)胞共同表達(dá)335個(gè)基因，其中239個(gè)基因在系膜細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中也有表達(dá)，主要參與能量代謝和蛋白質(zhì)合成；92個(gè)基因特異性在足細(xì)胞中富集表達(dá)，足細(xì)胞表達(dá)量是系膜細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)量的5倍以上。使用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)功能分析顯示，足細(xì)胞特異性富集表達(dá)基因主要與細(xì)胞伸展、細(xì)胞骨架、細(xì)胞粘附和離子轉(zhuǎn)運(yùn)等有關(guān)。研究人員認(rèn)為足細(xì)胞富集基因可能在足細(xì)胞存活、維持足細(xì)胞獨(dú)特結(jié)構(gòu)和功能中發(fā)揮重要作用。92個(gè)基因中有27個(gè)(29.4%)基因，如PODXL、PTPRO、VEGFA、ENPEP、IQGAP2、ARHGAP24、CD59A、COL4A3和GADD45A等,已有研究明確其在足細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能中發(fā)揮重要作用。

足細(xì)胞損傷機(jī)制研究新進(jìn)展

微小RNA(microRNA)在足細(xì)胞損傷中的作用microRNA表達(dá)存在組織特異性，腎臟富集的microRNA有miR-30a、miR-29a、miR-21、miR-143、miR-196b、miR-378、miR-27b、miR-148和let-7a等[14]。

miR-30是維持足細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)鍵調(diào)控分子[15]。miR-30a及miR-30d在腎小球足細(xì)胞中特異性表達(dá)，并且在FSGS患者中顯著下調(diào)[16]。TGF-β/Smad可通過(guò)Smad結(jié)合元件招募組蛋白去乙?；?，與NcoR形成轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合體，降低miR-30d啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性[17]。miR-30靶向抑制Notch1和p53信號(hào)通路活性，減少足細(xì)胞凋亡[16]。miR-30還通過(guò)抑制TRPC6、Ppp3ca/cb/r1和NFAT3c等分子，調(diào)控足細(xì)胞鈣/鈣調(diào)磷酸酶通路的活化，維持足細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)和功能[18]。

Gebeshuber等[19]研究發(fā)現(xiàn)miR-193a上調(diào)在FSGS發(fā)病中具有關(guān)鍵作用。miR-193a轉(zhuǎn)基因小鼠迅速出現(xiàn)廣泛足細(xì)胞融合、FSGS樣病變和蛋白尿，轉(zhuǎn)基因純合子小鼠和雜合子小鼠miR-193a誘導(dǎo)表達(dá)后分別于6周和12周后死亡。miR-193a抑制足細(xì)胞重要轉(zhuǎn)錄因子WT1的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致WT1靶基因PODXL、NPHS1，NPHS2、alpha-Actinin-4和synaptopodin等足細(xì)胞重要功能基因的表達(dá)下調(diào)，引發(fā)足細(xì)胞穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)的崩潰。

有研究認(rèn)為腎小球壁層上皮細(xì)胞(PEC)作為腎臟潛在祖細(xì)胞參與足細(xì)胞損傷修復(fù)。Kietzmann等[20]發(fā)現(xiàn)miR-193a調(diào)節(jié)壁層上皮細(xì)胞向足細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化。正常腎組織中，miR-193a主要表達(dá)在壁層上皮細(xì)胞，抑制miR-193a表達(dá)可誘導(dǎo)壁層上皮細(xì)胞向足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，表達(dá)PODXL、NPHS1和synaptopodin等足細(xì)胞標(biāo)志物，而壁層上皮細(xì)胞相關(guān)分子Claudin-1、UCH-L1和 Pax-8等表達(dá)顯著下調(diào)。在腎毒性血清腎炎模型中，鎖核苷酸抑制miR-193a可顯著降低新月形成和蛋白尿。

miR-29a與組織纖維化和蛋白質(zhì)乙?；嚓P(guān)。Wang[21]等發(fā)現(xiàn)糖尿病狀態(tài)和TGF-β抑制足細(xì)胞miR-29表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)膠原I/III/IV、α平滑肌肌動(dòng)蛋白(SMA)和波形蛋白(vimentin)mRNA和蛋白表達(dá)。Lin等[22]研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病狀態(tài)下miR-29a表達(dá)受到抑制，同時(shí)nephrin乙?；浇档?，TUNEL實(shí)驗(yàn)顯示足細(xì)胞凋亡； miR-29a抑制靶基因組蛋白去乙?；?(HDAC4)的表達(dá)，對(duì)HDAC7a和組蛋白乙酰化轉(zhuǎn)移酶p300/CB相關(guān)因子PCAF沒(méi)有影響。糖尿病小鼠過(guò)表達(dá)miR-29a可抑制HDAC4表達(dá)，改善腎功能，恢復(fù)nephrin乙酰化水平，降低nephrin泛素化；糖尿病小鼠注射外源miR-29a反義寡核苷酸顯著降低miR-29a表達(dá)，同時(shí)HDAC4表達(dá)上調(diào)，nephrin乙?；浇档停核鼗缴?，足細(xì)胞凋亡增多。

免疫與造血系統(tǒng)異常與足細(xì)胞損傷足細(xì)胞可被病原相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular pattern，PAMPs，如微生物病原體)或損傷相關(guān)分子模式(DAMP，如線粒體DAMPs)誘導(dǎo)的先天免疫應(yīng)答所損傷。TLR9是識(shí)別病毒和細(xì)菌中非甲基化DNA(CpG-DNA)的模式識(shí)別受體，可表達(dá)于疾病狀態(tài)下的足細(xì)胞。Xia等[23]和Bao等[24]發(fā)現(xiàn)TLR9可利用內(nèi)源性線粒體DNA(mtDNA)作為配體來(lái)促進(jìn)足細(xì)胞凋亡。該研究發(fā)現(xiàn)，足細(xì)胞內(nèi)源mtDNA是TLR9的配體，足細(xì)胞損傷因子嘌呤霉素可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)源mtDNA向溶酶體的轉(zhuǎn)移，與TLR9結(jié)合，激活TLR9信號(hào)通路，上調(diào)促凋亡信號(hào)通路NF-κB和p38 MAPK活性，誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡。

炎癥小體是由胞質(zhì)內(nèi)模式識(shí)別受體(PRR)參與組裝的多蛋白復(fù)合物，是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分。Zhang等[25]發(fā)現(xiàn)同型半胱氨酸可激活足細(xì)胞的NLRP3炎性小體，誘導(dǎo)腎小球硬化；敲低NLRP3接頭分子，凋亡相關(guān)點(diǎn)樣蛋白(ASC)或抑制 caspase-1 活性可以改善蛋白尿、足細(xì)胞足突融合和腎小球硬化。Fu等[26]最新研究發(fā)現(xiàn)，足細(xì)胞是致狼瘡性腎炎發(fā)病的直接參與者，足細(xì)胞中NLRP3炎癥小體激活參與狼瘡性腎炎的發(fā)病。研究顯示，大量蛋白尿的NZM2328狼瘡易感小鼠NLRP3和IL-1β的蛋白表達(dá)水平顯著高于不伴有蛋白尿的對(duì)照組小鼠，蛋白尿小鼠足細(xì)胞中caspase-1的含量顯著升高。狼瘡性腎炎患者足細(xì)胞和尿液中NLRP3升高。NLRP3抑制劑MCC950可顯著降低腎臟IL-1β的水平和足細(xì)胞caspase-1的活化，抑制足突融合，改善病理病變，降低蛋白尿。

可溶性尿激酶型纖溶酶原激活物受體(suPAR)是尿激酶型纖溶酶原激活物受體(uPAR)的可溶形式。suPAR通過(guò)與足細(xì)胞整合素結(jié)合，誘導(dǎo)足細(xì)胞遷移和凋亡，參與腎臟疾病，特別是FSGS和糖尿病腎病的發(fā)病進(jìn)程[27-29]，被認(rèn)為是導(dǎo)致FSGS的循環(huán)致病因子之一。高水平suPAR還與慢性腎臟病的發(fā)病和eGFR的下降相關(guān)[30]。Jochen Reiser課題組最新研究發(fā)現(xiàn)，suPAR源自骨髓Gr-1lo未成熟髓細(xì)胞[31]。將全身敲除uPAR的小鼠經(jīng)亞致死劑量放射線全身照射后，輸入野生型小鼠或uPAR基因敲除小鼠的骨髓細(xì)胞，形成骨髓嵌合體；輸入uPAR敲除小鼠骨髓細(xì)胞的嵌合體小鼠體內(nèi)幾乎沒(méi)有suPAR，LPS不能刺激小鼠產(chǎn)生蛋白尿；而輸入野生型小鼠骨髓細(xì)胞的嵌合體小鼠經(jīng)LPS刺激后，血液和尿液中suPAR水平升高，同時(shí)出現(xiàn)蛋白尿。NOD-scid IL-2rnull(NSG)嚴(yán)重免疫缺陷小鼠缺乏淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞，白細(xì)胞群體主要由髓系譜系細(xì)胞組成，LPS可以刺激NSG小鼠骨髓Gr-1lo未成熟髓細(xì)胞顯著增加，進(jìn)而出現(xiàn)suPAR表達(dá)升高和蛋白尿；移植蛋白尿小鼠的骨髓可導(dǎo)致受體小鼠產(chǎn)生蛋白尿，F(xiàn)SGS復(fù)發(fā)患者的外周造血干細(xì)胞輸注到小鼠可引起小鼠骨髓Gr-1lo髓細(xì)胞擴(kuò)增，血液和尿液suPAR升高，小鼠出現(xiàn)足細(xì)胞損傷和蛋白尿。上述研究進(jìn)一步證實(shí)了循環(huán)suPAR在FSGS等腎臟疾病中的直接作用，而骨髓Gr-1lo未成熟髓細(xì)胞是suPAR的主要來(lái)源，提示suPAR相關(guān)性腎臟病可能源于骨髓或外周造血干細(xì)胞異常，干細(xì)胞移植可能是治療suPAR相關(guān)腎臟疾病的可行策略。

小結(jié):足細(xì)胞是腎小球?yàn)V過(guò)屏障重要組成部分。足細(xì)胞損傷是導(dǎo)致蛋白尿、腎小球硬化及腎功能進(jìn)行性惡化的病理生理基礎(chǔ)。單細(xì)胞測(cè)序和生物信息學(xué)分析繪制了足細(xì)胞特異性基因表達(dá)譜，提示維持足細(xì)胞功能和結(jié)構(gòu)的重要基因。遺傳學(xué)和基因編輯技術(shù)的進(jìn)展為研究足細(xì)胞損傷和蛋白尿發(fā)生機(jī)制奠定了分子基礎(chǔ)。非編碼RNA、免疫因素、腎臟固有細(xì)胞及腎臟與腎外器官的相互作用在足細(xì)胞損傷中的作用，值得關(guān)注和進(jìn)一步研究。足細(xì)胞損傷進(jìn)程中的系列關(guān)鍵分子均可作為足細(xì)胞定向治療的潛在靶標(biāo)，值得系統(tǒng)解析和評(píng)價(jià)，多能干細(xì)胞移植作為治療慢性腎臟病，包括足細(xì)胞損傷的新途徑，日益受到重視。