陳敬根，周 凌，汪 渝，張 奎

0 引言

潰瘍性結腸炎(Ulcerative colitis，UC)是一類由包括遺傳、環(huán)境等多種因素參與的自身免疫疾病，屬于炎癥性腸病的一種，但病因尚不明確[1]。UC主要累及乙狀結腸，病理表現(xiàn)為淺表結腸組織發(fā)生彌漫、連續(xù)性潰瘍糜爛[2]。目前，臨床上主要采用激素或免疫抑制劑類藥物對該病進行治療[3]。但此類治療方法均無法根治，近年來，以間充質干細胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)移植治療為主的細胞療法在包括UC在內自身免疫疾病的治療中逐漸得到重視[4]。間充質干細胞是一種具備自我更新能力的多潛能干細胞，研究表明，其可通過影響固有免疫細胞及免疫調節(jié)細胞，進而發(fā)揮免疫調節(jié)作用[5]。因此，該細胞類型已被研究用于治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus，SLE)和類風濕關節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)等多種自身免疫疾病，并取得較好的治療效果[6-7]。最近研究表明，某些中藥成分具有促進間充質干細胞歸巢作用，可發(fā)揮增強間充質干細胞移植治療的效果[8]。因此，本課題通過研究黃芩素對間充質干細胞向大鼠潰瘍性結腸炎病損部位歸巢作用的影響，為該藥物作為輔助間充質干細胞移植治療潰瘍性結腸炎的可行性奠定前期研究基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑 6周齡的雌性SD大鼠，購自南京模式動物研究中心；黃芩素(20 mg，F(xiàn)Y12960708)購自南京飛宇生物科技有限公司?？筂usashi-1抗體購自Abcam，美國(ab129819)；抗Lgr5抗體購自Santa，德國(sc-68580)；抗Ephrin B3抗體購自Abcam，美國(ab101699)。

1.2 間充質干細胞提取、鑒定及體外黃芩素預處理 腹腔注射戊巴比妥鈉(100 mg/kg)麻醉后處死大鼠，分離股骨及脛骨并置于75%乙醇5 min。無菌條件下，使用M199培養(yǎng)基反復沖洗骨髓腔，收集洗滌液并重懸為單細胞懸液。1 500 r/min 5 min離心單細胞懸液后棄去上清。隨后用含10%FBS及1%雙抗的M199培養(yǎng)基重懸細胞沉淀后，進行接種培養(yǎng)。間隔3～4 d換液1次，當細胞長至90%培養(yǎng)瓶底面積時行細胞傳代。

取第3代細胞，利用0.25%胰蛋白酶消化80%融合的細胞，1 000 r/min離心5 min，用PBS洗滌細胞沉淀2次，并重懸為1×106/L的細胞懸液。吸取100 μl上述細胞懸液于兩個EP管中，并分別加入PE標記的抗CD45及CD59抗體。室溫孵育30 min后行流式細胞術檢測。上述細胞重懸1×106/L的細胞懸液后分為2組：空白組及黃芩素處理組。在細胞增殖至50%密度時，黃芩素處理組加入1 ml含黃芩素的完全培養(yǎng)基至藥物終濃度為100 ng/ml，空白組加入1 ml完全培養(yǎng)基。隨后共培養(yǎng)24 h。

1.3 潰瘍性結腸炎模型構建及分組 利用TNBS灌腸法制作大鼠潰瘍性結腸炎模型。大鼠造模前禁食1 d，水合氯醛麻醉后大鼠直腸注入造模液(100 mg/kg TNBS+50%乙醇0.25 ml)，誘導潰瘍性結腸炎模型。造模成功后，將40只大鼠隨機分為4組(空白組、模型組、MSCs組及黃芩素干預MSCs組)，其中空白組不造UC模型。模型組及空白組分別經(jīng)尾靜脈注射1 ml PBS，MSCs組經(jīng)尾靜脈注射1 ml細胞懸液(1.0×106個)，黃芩素干預MSCs組經(jīng)尾靜脈注射1 ml黃芩素處理后的細胞懸液(1.0×106個)。

1.4 間充質干細胞歸巢效果評估

1.4.1 免疫組化法檢測干細胞標志物Musashi-1的表達 大鼠尾行靜脈注射后每隔5 d處死3只大鼠，收集結腸組織進行石蠟切片。常規(guī)利用二甲苯脫蠟及梯度乙醇脫水，加入0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH=6.0)，并于微波爐內微波輻射10 min進行抗原修復。PBS洗5次后，山羊血清進行室溫封閉10 min，隨后加入一抗(抗Musashi-1) 4 ℃過夜；PBS洗滌后，加入生物素標記二抗，37 ℃孵育30 min后加入顯色劑(DAB)，流水沖洗后封片觀察。采用半定量積分法計算染色積分，即分別對陽性細胞數(shù)及其著色程度進行分級計分，結果以2項之積表示。陽性細胞率：每張切片隨機檢測5個視野(400×)，所見的陽性細胞分為0～4級(共5級)：0級為陰性，記0分；1級陽性細胞占1%～25%，記1分；2級陽性細胞占26%～50%，記2分；3級陽性細胞占51%～75%，記3分；4級陽性細胞占76%～100%，記4分。

1.4.2 Western blot法檢測Lgr5和Ephrin-B3在結腸的表達水平 隨機抽取不同部位的腸黏膜組織20 mg，裂解并提取結腸組織中的總蛋白，使用BCA法測定蛋白濃度。將蛋白上清與蛋白上樣緩沖液構成40 μl體系，在變性條件下進行12%聚丙烯酰胺凝膠中電泳，將目的蛋白轉移到PVDF膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；PBST洗3次，5 min/次；加入抗Lgr5抗體、抗Ephrin B3抗體，室溫孵育1 h；PBST洗3次，5 min/次；加入相應的HRP標記的二抗，室溫孵育1 h；洗膜后ECL顯色。結果采用Image J進行半定量分析。

2 結果

2.1 間充質干細胞鑒定 骨髓提取的間充質單細胞傳代培養(yǎng)3次后，利用流式細胞術檢測干細胞表面標志物的表達情況。流式結果表明，經(jīng)過提取及傳代培養(yǎng)后，91.6%的細胞表面有CD90的表達，而CD45的表達量僅為3.98%，表明本實驗所用細胞屬于CD90+/CD45-的干細胞。見圖1。

圖1 間充質干細胞流式細胞術鑒定結果

2.2 免疫組化分析腸道干細胞標志物Musashi-1的表達情況 對結腸切片進行免疫組化染色，Musashi-1染色積分值及免疫組織化學染色結果如表1、圖2所示。t檢驗結果顯示，在尾靜脈注射后第5天，模型組的Musashi-1積分值低于黃芩素干預MSCs組，差異有統(tǒng)計學意義(t=2.402，P=0.043)；但黃芩素干預MSCs組的Musashi-1積分值與MSCs組比較，差異無統(tǒng)計學意義(t=1.271，P=0.240)。給藥后第10天，黃芩素干預MSCs組的Musashi-1積分值高于第10天模型組及MSCs組的積分值，差異有統(tǒng)計學意義(t=6.854，P<0.001；t=3.348，P=0.010)。

表1 各組間Musashi-1的表達情況分析(n=5)

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與MSCs組比較，#P<0.05

2.3 Western blot檢測Lgr5和Ephrin-B3在結腸的表達水平 見圖3、圖4。應用Western blot檢測各組大鼠結腸組織在不同時間點Lgr5和Ephrin-B3表達水平差異。結果顯示，黃芩素干預MSCs組結腸組織的Lgr5和Ephrin-B3表達量高于空白組、模型組、MSCs組。

圖2 各組大鼠腸道Musashi-1免疫組化染色結果

圖3 各組結腸組織Lgr5和Ephrin-B3表達水平

圖4 各組結腸組織Lgr5和Ephrin-B3相對表達水平

3 討論

潰瘍性結腸炎患者腸道處于反復炎癥狀態(tài)，因此被認為是一種難治性癌前病變。此類患者的結腸黏膜組織受到反復破壞的同時，也伴隨著機體免疫調節(jié)功能失衡，因此，糾正失調的免疫功能并修復受損腸黏膜屏障是治療潰瘍性結腸炎的關鍵[9-13]。中醫(yī)理論認為，潰瘍性結腸炎屬于“痢疾”、“久痢”和“腸澼”等范疇[14]，包括黃芩湯在內的多種方劑均可治療該病，并取得了良好效果[15]。但黃芩湯治療潰瘍性結腸炎的藥理機制不明，因此，本研究選擇黃芩湯的主要藥理成分黃芩素作為研究對象，從間充質干細胞歸巢角度，初步分析黃芩素在治療潰瘍性結腸炎中的可能機制，為今后深入研究其藥理作用奠定前期研究基礎。

間充質干細胞屬于多潛能干細胞，存在于包括臍帶血及骨髓等多種組織器官內，在適當環(huán)境下可分化為多種三胚層細胞，參與機體組織修復過程[4]。本研究經(jīng)由骨髓中提取間充質干細胞，并利用其貼壁生長的特點選用經(jīng)3次傳代培養(yǎng)后的細胞進行實驗。經(jīng)過傳代培養(yǎng)后，骨髓來源MSCs呈現(xiàn)貼壁生長的特性。公認的觀點認為，間充質干細胞表面存在多種分子標志，包括CD90、CD105、CD166等抗原陽性，以及CD45、CD14、CD34等抗原陰性。本研究選取CD90+及CD45-作為表面特異分子標志[16]。流式結果表明，經(jīng)3代傳代培養(yǎng)后的細胞表面CD90、CD45的陽性率分別為91.6%、3.98%，呈現(xiàn)間充質干細胞特點(CD90+/CD45-)，可用于后期尾靜脈回輸實驗。

成體干細胞是治療潰瘍性結腸炎的首選細胞，主要存在于結腸隱窩基底部，但該細胞難以獲得及體外擴增困難的特點導致其無法用于臨床治療。因此，目前研究主要集中在造血干細胞(Hematopoietic stem cells，HSCT)及MSCs移植的研究上。MSCs具有向病損部位歸巢的特性，在病灶部位聚集后可參與靶組織的修復過程。但MSCs向腸道的歸巢效率較低，有研究表明，靜脈注射人干細胞到裸鼠體內后，僅0.13%的干細胞可在小鼠腸道組織中被檢測到[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，在尾靜脈注射未處理的MSCs后的第5天及第10天，腸道干細胞標志物Musashi-1與空白組及模型組無顯著性差異，表明未經(jīng)處理的間充質干細胞歸巢至受損腸道組織并分化為腸道干細胞的數(shù)量較少，與既往研究相符。但黃芩素干預MSCs組的大鼠結腸組織的Musashi-1在不同時間點(第5、10天)均高于MSCs組，初步提示黃芩素可促進MSCs歸巢及向腸干細胞分化，發(fā)揮治療潰瘍性結腸炎的作用。

Lgr5和Ephrin-B3是未成熟的腸黏膜細胞標志物，其中Lgr5表達在腸分泌細胞的前體，腸分泌細胞可通過分泌黏液對腸道起潤滑作用，對腸黏膜屏障的構成具有重要意義。而Ephrin-B3則是一種表達結腸隱窩底部的標記物，在潰瘍性結腸炎患者的結腸組織中隱窩被嚴重破壞，抑制原有腸干細胞對受損結腸組織的修復[18]。Western blot結果顯示，黃芩素干預MSCs組的Lgr5和Ephrin-B3表達水平均明顯高于其他各組，提示尾靜脈輸注黃芩素干預MSCs，可促進腸分泌細胞的分化，并且對結腸隱窩的重建亦有促進作用。

同時，本研究也存在一些不足。黃芩素對于MSCs增殖、分化能力的影響也可能是其發(fā)揮促進MSCs歸巢的潛在基礎，因此，應針對黃芩素對MSCs的直接影響開展研究；并且本研究尚缺乏大鼠潰瘍性結腸炎癥狀改善程度的評估，也需后期進一步實驗進行補充。

綜上所述，黃芩素可通過促進MSCs向結腸組織歸巢來參與腸道黏膜屏障的重建，并發(fā)揮治療潰瘍性結腸炎的作用。