李 楊 胡 淼 謝鳳英,2 齊寶坤 孫禹凡

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院， 哈爾濱 150030； 2.哈爾濱市食品產(chǎn)業(yè)研究院， 哈爾濱 150028)

0 引言

紫蘇是唇形科一年生草本植物，多種植于亞洲國家[1]。紫蘇籽中含有35%～45%的油脂，90%為不飽和脂肪酸，其中α-亞麻酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為52.58%～61.98%。同時，紫蘇油中含有18種氨基酸，必需氨基酸的含量較高，其中賴氨酸和甲硫氨酸明顯高于小麥、玉米等常見經(jīng)濟植物[2]。有研究表明[3-4]，紫蘇油具有降血脂、抗氧化、抗衰老、提高免疫力、增強記憶力等功效。由于紫蘇油幾乎不溶于水，其生物利用率較低，且紫蘇油中的主要活性物質(zhì)是不飽和脂肪酸，結(jié)構(gòu)中含有雙鍵，導(dǎo)致其不穩(wěn)定極易發(fā)生氧化酸敗，尤其環(huán)境因素(溫度、光照、催化劑等)會加劇不飽和脂肪酸氧化的過程[5-6]。目前主要通過添加人工抗氧化劑或制備成軟膠囊防止紫蘇油氧化，提高其生物利用率，而人工抗氧化劑具有一定的毒副作用，軟膠囊的粒徑較大，吸收效率較低，未能達到所期望的效果。吳旭錦[2]利用有機小分子表面活性劑(吐溫80)制備紫蘇油納米乳液，與傳統(tǒng)的紫蘇油相比可以提高紫蘇油降低血脂的能力，但是有機小分子表面活性劑對人體健康有一定的影響，因此開發(fā)一種新的表面活性劑來穩(wěn)定紫蘇油納米乳液具有重要的意義。

大豆分離蛋白(Soy bean protein isolate, SPI)因其具有多種功能特性而在食品工業(yè)中得以廣泛的應(yīng)用，其中乳化性是較為重要的功能特性，而單一的SPI由于受到結(jié)構(gòu)影響，容易變質(zhì)，限制了其在食品工業(yè)中作為乳化劑的應(yīng)用[7]。卵磷脂是一種雙親性的小分子表面活性劑，易在油水界展開，可降低表面張力。BECKWITH[8]、NIEUWENHUYZEN等[9]研究發(fā)現(xiàn)，大豆蛋白與卵磷脂之間通過靜電作用和疏水作用產(chǎn)生交互作用。有研究表明[10-11]，在乳液中添加磷脂酰膽堿可以提高乳液的乳化活性和乳化穩(wěn)定性。同時利用超高壓均質(zhì)技術(shù)的空穴效應(yīng)可以使蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，使乳液的粒徑降低，形成納米乳液(粒徑10～500 nm)，提高乳液的穩(wěn)定性。

目前，鮮有人研究利用超高壓均質(zhì)技術(shù)，以SPI、磷脂酰膽堿作為表面活性劑制備紫蘇油納米乳液技術(shù)及其相關(guān)性質(zhì)。由于納米乳液具有粒徑小、性質(zhì)穩(wěn)定等特點，將紫蘇油制成納米乳液不僅可以延長紫蘇油氧化變質(zhì)的時間，同時還可以增大紫蘇油在人體內(nèi)的生物利用率，促進紫蘇油在人體內(nèi)的消化吸收。

本文以SPI、大豆卵磷脂作為表面活性劑，以紫蘇油作為油相，采用超高壓均質(zhì)技術(shù)制備紫蘇油納米乳液，探究不同SPI質(zhì)量分?jǐn)?shù)和超高壓均質(zhì)壓力對紫蘇油納米乳液穩(wěn)定性的影響，以期為工業(yè)生產(chǎn)提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白603，上海賀普實業(yè)有限公司；紫蘇油，哈爾濱普潤油脂有限公司；磷脂酰膽堿，北京索萊寶科技有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉，北京新光化工試劑廠；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Mastersizer 2000型粒度儀，英國馬爾文儀器有限公司；GL-21M型高速冷凍離心機，上海市離心機械研究所；FB-110T型超高壓均質(zhì)機，上海勵途機械設(shè)備工程有限公司；UTL2000型乳化機，德國 IKA儀器設(shè)備公司；TURBISCAN型穩(wěn)定性分析儀，北京朗迪森科技有限公司；J-810型圓二色譜儀，日本Jasco公司。

1.3 紫蘇油納米乳液的制備

將不同濃度的大豆分離蛋白(質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%、3%、4%)溶液與磷脂酰膽堿在室溫(25℃)下攪拌2 h，使大豆分離蛋白與磷脂酰膽堿充分溶解并發(fā)生相互作用，在終溶液中加入5%的紫蘇油，采用乳化機在20 000 r/min下乳化3 min，得到粗乳液，之后在不同的高壓均質(zhì)壓力(100、120、140 MPa)下進行再次乳化，其中高壓均質(zhì)的次數(shù)為2次。

1.4 平均粒徑、PDI值及Zeta電位

采用Mastersizer 2000型粒度儀測定紫蘇油納米乳液的平均粒徑、PDI值和Zeta電位。將不同條件下制備的紫蘇油納米乳液稀釋2 000倍，其中顆粒折射率為1.46，分散劑折射率為1.33，吸收參數(shù)為0.001[12]，測定溫度為25℃，平衡時間為2 min，計算3次重復(fù)試驗得到的平均值。

1.5 物理穩(wěn)定性

參照呂長鑫等[13]的方法，將被測樣品放入樣品池中，采用近紅外光作為光源，在室溫下，使用探頭從樣品池的底部到樣品池的頂部每隔1 min測量一次，從底部到頂部的一次測量成為一次掃描，新鮮的紫蘇油納米乳液掃描30 min, 放置21 d 后的紫蘇油納米乳液重新掃描30 min。由于紫蘇油納米乳液外觀不透明，本研究只討論背散射光特征隨時間的變化情況，分析紫蘇油納米乳液的物理穩(wěn)定性。

1.6 儲藏穩(wěn)定性

紫蘇油納米乳液在常溫下儲藏，每隔5 d測定納米乳液的平均粒徑，持續(xù)觀察21 d，具體步驟如下：將紫蘇油納米乳液用0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液(pH值7.5)稀釋2 000倍，用Mastersizer 2000型粒度儀測定，其中顆粒折射率為1.46，分散劑折射率為1.33，吸收參數(shù)為0.001[12]，測定溫度為25℃，平衡時間為2 min。

1.7 圓二色譜

新鮮的紫蘇油納米乳液在10 000g、室溫下離心30 min，取出上層的乳化層，將乳化層與冷凍的丙酮(按液料比20 mL/g)在-18℃下反應(yīng)2 h，離心分離(10 000g，15 min，4℃)得到沉淀的蛋白，之后用丙酮清洗5～6次，最后得到的蛋白沉淀進行冷凍干燥，得到界面蛋白的粉末。

利用圓二色譜測定界面蛋白二級結(jié)構(gòu)的變化，將樣品溶于0.01 mol/L磷酸鹽緩沖溶液中(pH值7.4)，并用去離子水將樣品濃度稀釋到0.5 mol/L，25℃下，以100 nm/min 掃描速率在190～260 nm范圍內(nèi)掃描，樣品池光程為1 mm，分辨率0.1 nm。采用CDPro曲線擬合軟件對數(shù)據(jù)處理分析求得二級結(jié)構(gòu)相對含量，每組樣品重復(fù)測定 3 次。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用SSPS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行處理，所有試驗均為3次重復(fù)試驗，用 Origin 8.5 軟件繪制趨勢曲線圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 納米乳液的粒徑及PDI值

由圖1a可知，隨著均質(zhì)壓力和SPI質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，納米乳液的平均粒徑逐漸降低，當(dāng)均質(zhì)壓力為140 MPa、SPI質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%時，納米乳液的平均粒徑最小為241.03 nm。圖1b為納米乳液的PDI值，PDI值表征聚合物的分子量分布，PDI值越小表示乳液分布得越均勻，由圖1b可知，在140 MPa、SPI質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%條件下納米乳液的PDI值達到最低。PATIL等[14]、DEY等[15]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著表面活性劑濃度的增加，納米乳液的平均粒徑逐漸降低，這些結(jié)果與本文的試驗結(jié)果相似。研究表明大豆分離蛋白具有良好的表面活性[16]，以大豆分離蛋白作為納米乳液的表面活性劑可以降低油水界面的界面張力，并且隨著濃度的增加，大豆分離蛋白能夠緊密包裹在油滴的表面，防止油滴發(fā)生聚合現(xiàn)象，增強油滴的穩(wěn)定性；納米乳液中的紫蘇油與原紫蘇油相比，表面積增加，不僅可以防止紫蘇油氧化，同時也可以增加紫蘇油的生物利用率[17]。

圖1 紫蘇油納米乳液的平均粒徑及PDI值 Fig.1 Average particle size and PDI value of perilla oil nanoemulsion 注：圖中不同字母表示差異顯著，下同。

2.2 納米乳液的ζ-電位

圖2 紫蘇油納米乳液的ζ-電位 Fig.2 Zeta-potential of perilla oil nanoemulsion

ζ-電位是用來表征油滴之間靜電斥力的一種方法。從理論上來說，ζ-電位的絕對值小于30 mV，表明乳液的穩(wěn)定性較弱，而ζ-電位的絕對值大于30 mV，表明乳液的穩(wěn)定性較強[18]。圖2所示為紫蘇油納米乳液的ζ-電位，由圖2可知，隨著SPI質(zhì)量分?jǐn)?shù)和高壓均質(zhì)壓力的增加，紫蘇油納米乳液的ζ-電位逐漸降低，其中在SPI質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%、均質(zhì)壓力140 MPa下紫蘇油納米乳液的ζ-電位最低，表明在此條件下紫蘇油納米乳液表面有較多的同種電荷，彼此之間有較高的靜電斥力，防止液滴發(fā)生聚合，因此在此條件下紫蘇油納米乳液有較高的穩(wěn)定性。但所有條件下制備的紫蘇油納米乳液的ζ-電位絕對值均低于25 mV，SALVIA-TRUJILLO[19]等探究不同精油納米乳液的穩(wěn)定性和抗菌特性時，表明不同精油納米乳液的ζ-電位絕對值均低于30 mV，DEY等[15]也報道了利用芝麻分離蛋白制備的納米乳液的ζ-電位在(-11.98±0.598)mV，絕對值低于30 mV。這可能是由于不同油脂之間的離子組成以及分散的水平不同所導(dǎo)致的[20]。

2.3 物理穩(wěn)定性

圖3 紫蘇油納米乳液的物理穩(wěn)定性 Fig.3 Physical stability of perilla oil nanoemulsions

利用Turbiscan穩(wěn)定性分析儀測定紫蘇油納米乳液的物理穩(wěn)定性。Turbiscan穩(wěn)定性分析采用880 nm近紅外光源，由于紫蘇油納米乳液屬于不透明液體，因此只需檢測樣品的背散射光強度的變化率(BS)，來反映樣品的穩(wěn)定性[13]。Turbiscan穩(wěn)定性分析掃描的范圍為0～40 mm，其中左邊為樣品的底部，右邊為樣品的頂部，左邊曲線向上移動表明樣品發(fā)生沉淀，右邊曲線向上移動表明脂肪上浮，中間的曲線發(fā)生波動則表明有聚合現(xiàn)象[21]。圖3、4為不同的SPI質(zhì)量分?jǐn)?shù)和超高壓均質(zhì)壓力對紫蘇油納米乳液物理穩(wěn)定性的影響，其中圖3為新制備的紫蘇油納米乳液Turbiscan穩(wěn)定性分析結(jié)果，從圖3可以看出所有樣品左邊曲線未出現(xiàn)向上移動的現(xiàn)象，說明樣品沒有發(fā)生沉淀；中間的曲線比較平緩并且無異常的波動，樣品比較均勻未發(fā)生聚合現(xiàn)象；右邊曲線未向上移動，表明無脂肪析出，綜上所述，新制備的紫蘇油納米乳液具有較強的穩(wěn)定性，未出現(xiàn)沉淀、脂肪上浮、聚合等現(xiàn)象。圖4為紫蘇油納米乳液在室溫下放置21 d后紫蘇油納米乳液的穩(wěn)定性分析結(jié)果，從圖4可以看出，不同SPI質(zhì)量分?jǐn)?shù)和超高壓均質(zhì)壓力下制備的紫蘇油納米乳液在曲線的左側(cè)未向上移動，中間曲線也無波動現(xiàn)象，表明乳液未發(fā)生聚合和沉淀現(xiàn)象；而在右側(cè)曲線部分，除了圖4g～4i以外，其他圖中均出現(xiàn)了曲線上移的現(xiàn)象，說明有脂肪析出的現(xiàn)象，這可能是由于SPI的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低，未能將油滴完全包裹，而使油滴發(fā)生聚合，出現(xiàn)脂肪上浮的現(xiàn)象。而在圖4g～4i中，圖4i的曲線最穩(wěn)定，圖4i為4% SPI、140 MPa下制備的紫蘇油納米乳液，表明在這一條件下制備的紫蘇油納米乳液具有較強的穩(wěn)定性，這說明在140 MPa的高壓均質(zhì)下，4%的SPI能夠較好地覆蓋在油滴的表面，防止油滴發(fā)生聚集[22]。2.1節(jié)、2.2節(jié)的結(jié)果也證明了此結(jié)論。

圖4 紫蘇油納米乳液室溫下放置21 d后的物理穩(wěn)定性 Fig.4 Physical stability of perilla oil nanoemulsions after 21 d

圖5 紫蘇油納米乳液的儲藏穩(wěn)定性 Fig.5 Storage stability of perilla oil nanoemulsions

2.4 儲藏穩(wěn)定性

圖5為不同條件下制備的紫蘇油納米乳液在室溫下儲藏的平均粒徑的變化。由圖5可知，所有的紫蘇油納米乳液的樣品在前16 d的平均粒徑無明顯的變化，與新制備的紫蘇油納米乳液平均粒徑相近。而在第21天時，紫蘇油納米乳液的粒徑明顯增加。圖5a為在2%SPI條件下，不同高壓均質(zhì)壓力下紫蘇油納米乳液平均粒徑的變化，由圖可知，紫蘇油納米乳液在21 d時，平均粒徑增加至400 nm以上；圖5b為在3% SPI條件下，不同高壓均質(zhì)壓力下紫蘇油納米乳液平均粒徑的變化，由圖可知，紫蘇油納米乳液在21 d時，平均粒徑明顯的增加，但平均粒徑低于2%條件下的紫蘇油納米乳液,產(chǎn)生此現(xiàn)象的原因可能是SPI的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低，不能將油滴完全包裹，油滴之間發(fā)生聚合，本文中2.3節(jié)的物理穩(wěn)定性也表明在儲藏21 d后紫蘇油納米乳液出現(xiàn)脂肪析出現(xiàn)象，圖5c為在4% SPI條件下，不同高壓均質(zhì)壓力下紫蘇油納米乳液平均粒徑變化, 由圖可知，在140 MPa下紫蘇油納米乳液的平均粒徑與新鮮的紫蘇油納米乳液平均粒徑相當(dāng)，這說明在此條件下，納米乳液具有較好的物理穩(wěn)定性和儲藏穩(wěn)定性，這可能是由于高壓均質(zhì)產(chǎn)生的壓力作用、高頻振蕩和對流撞擊等機械力誘導(dǎo)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使蛋白更容易吸附在油水界面，形成均一穩(wěn)定的紫蘇油納米乳液[23]。

2.5 圓二色譜

圓二色譜是一種精準(zhǔn)分析蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的常用手段，能夠在蛋白液體中直接測定[24]。本文選擇能夠反映肽鍵圓二色性的遠(yuǎn)紫外區(qū)(190～260 nm)光譜條件，對不同條件的紫蘇油納米乳液中界面蛋白二級結(jié)構(gòu)進行分析。圖6為紫蘇油納米乳液中界面蛋白的圓二圖譜，表1為不同條件下紫蘇油納米乳液中界面蛋白二級結(jié)構(gòu)相對含量變化。經(jīng)超高壓均質(zhì)后，界面蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的變化，從表1可知，界面蛋白中的α-螺旋相對含量較低，β-折疊和無規(guī)卷曲的相對含量較高，其中界面蛋白中的二級結(jié)構(gòu)主要以無規(guī)卷曲為主。這可能是由于磷脂酰膽堿與SPI中的α-螺旋結(jié)構(gòu)結(jié)合。增加高壓均質(zhì)的壓力α-螺旋結(jié)構(gòu)相對含量降低，這可能是高壓均質(zhì)產(chǎn)生的壓力作用、高頻振蕩和對流撞擊等機械力誘導(dǎo)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而改變界面蛋白在油滴表面的分布，進而影響紫蘇油納米乳液的穩(wěn)定性。高壓均質(zhì)改變蛋白的結(jié)構(gòu)，使得蛋白-磷脂酰膽堿具有較好的均勻性和較強的乳化性，增強紫蘇油納米乳液的穩(wěn)定性[25]。

圖6 紫蘇油納米乳液界面蛋白圓二色譜 Fig.6 Circular dichroism spectrum of perilla oil nanoemulsions

均質(zhì)壓力/MPaSPI質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%相對含量/%α-螺旋β-折疊β-轉(zhuǎn)角無規(guī)卷曲1002(7.8±0.8)a(32.2±0.8)a(18.1±0.3)c(40.9±0.2)b3(7.5±0.2)a(28.0±0.9)c(21.4±0.4)a(43.2±0.3)a4(7.3±0.3)b(33.0±0.0)a(18.1±0.6)b(41.6±0.5)b1202(6.8±0.6)c(31.9±0.2)a(19.0±0.5)b(42.3±0.4)b3(6.6±0.2)c(32.0±0.3)a(19.0±0.3)b(42.5±0.3)b4(6.7±0.1)c(36.3±0.5)a(17.2±0.6)c(39.8±0.2)d1402(5.9±0.4)d(28.8±0.4)c(21.2±0.5)a(44.1±0.1)a3(5.6±0.6)d(34.1±0.1)b(17.4±0.4)c(42.9±0.5)a4(5.7±0.4)d(34.2±0.2)b(16.6±0.1)d(43.5±0.4)a

注：同列不同小寫字母表示差異顯著。

3 結(jié)束語

以SPI-磷脂酰膽堿為表面活性劑，利用超高壓均質(zhì)技術(shù)制備紫蘇油納米乳液，研究紫蘇油納米乳液的穩(wěn)定性，得出以下結(jié)論：不同SPI質(zhì)量分?jǐn)?shù)和超高壓均質(zhì)壓力對紫蘇油納米乳液的穩(wěn)定性具有一定的影響，隨著SPI質(zhì)量分?jǐn)?shù)和超高壓均質(zhì)壓力的增加，紫蘇油納米乳液的穩(wěn)定性逐漸增加；超高壓均質(zhì)通過改變紫蘇油納米乳液中界面蛋白的結(jié)構(gòu)來影響紫蘇油納米乳液的穩(wěn)定性。