徐紅華 譚俊艷 謝明明 丁 瑞 關(guān) 琛 王 欣

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院， 哈爾濱 150030)

0 引言

乳清蛋白經(jīng)常作為發(fā)泡劑應(yīng)用于蛋白糖餅、蛋糕、人造奶油和發(fā)酵面包等發(fā)泡性食品中。在低pH值(小于2.5)、低離子強度、高溫長時間加熱條件下，許多蛋白質(zhì)能夠自組裝形成長的、有分支/無分支、半柔性淀粉樣纖維[1]，如乳清濃縮蛋白(WPC)[2-3]、β-乳球蛋白[4-5]、大豆蛋白[6]、牛血清白蛋白[7]和溶菌酶[8]。由于其較高的縱橫比(長度與直徑比值)，纖維狀聚合物可被用作增稠劑、膠凝劑[9-10]和乳化穩(wěn)定劑[11-12]。在眾多的性質(zhì)中，蛋白纖維聚合物起泡性與泡沫穩(wěn)定性遠優(yōu)于蛋白質(zhì)的常規(guī)聚合物[13]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，成熟纖維還可以促進蛋白質(zhì)纖維化作用[14]。KREBS等[15]發(fā)現(xiàn)了成熟纖維加入到蛋白溶液中可加速形成母雞溶菌酶纖維，并形成無分枝的致密網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。然而，關(guān)于纖維誘導(dǎo)蛋白成纖維的研究主要集中在聚合機理以及形成條件上，缺乏功能性質(zhì)的研究。而纖維誘導(dǎo)蛋白形成的纖維化作用與其非誘導(dǎo)情況下自發(fā)形成的纖維作用，在功能方面是否存在差異尚缺乏研究。因此，本文采用乳清濃縮蛋白中加入一定量的成熟纖維，比較纖維誘導(dǎo)乳清濃縮蛋白成纖維與乳清濃縮蛋白自發(fā)形成纖維過程中起泡性的差異，以期為乳清濃縮蛋白納米纖維的應(yīng)用提供新的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

主要材料有：乳清濃縮蛋白WPC-80(美國HILMA公司)；硫黃素 T、8-苯氨基-1-萘磺酸(ANS)(Sigma公司)；DTNB(Merck公司)；其他試劑均為分析純。

主要儀器有：KDN-102C型半自動定氮儀(上海纖檢儀器有限公司)；Allegra64R centrifuge型離心機(德國BECKMAN公司)；DK-98-ⅡA型恒溫磁力水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)；F-4500型熒光分光光度計(日本日立公司)；DELTA320型pH計(梅特勒-托利多儀器有限公司)；UV-240IPC型紫外可見分光光度計(日本島津公司)；DS-1型高速組織搗碎機(上海精科實業(yè)有限公司)；JEM-1200EX型透射電子顯微鏡(日本日立公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1樣品的制備

乳清濃縮蛋白自發(fā)形成纖維(WPC自發(fā))：按照前期研究的制備方法[2-3]，取4.00 g乳清濃縮蛋白WPC-80溶于去離子水中，用6 mol/L HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至2.0并定容至100 mL，16 000g、4℃離心20 min，取中間清液，利用凱氏定氮法測定蛋白含量，隨即用pH值2.0去離子水(用6 mol/L HCl調(diào)節(jié)去離子水的pH值至2.0)稀釋蛋白質(zhì)量分數(shù)至2.0%，90℃水浴加熱10 h，取樣并4℃冰箱保存。自發(fā)形成纖維過程中每隔1 h取樣(0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 h)并4℃冰箱保存。2.0%乳清濃縮蛋白溶液在pH值2.0、90℃水浴加熱10 h，樣品為成熟纖維。

纖維誘導(dǎo)乳清濃縮蛋白形成纖維(纖維誘導(dǎo)WPC)：上述制備的2.0%乳清濃縮蛋白溶液中加入成熟纖維(纖維與乳清濃縮蛋白混合質(zhì)量比為1∶3，蛋白終質(zhì)量分數(shù)為2.0%)，90℃水浴加熱(0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 h)，取樣并4℃冰箱保存。

乳清濃縮蛋白自發(fā)形成空白樣(WPC空白)：上述制備的2.0%乳清濃縮蛋白溶液中加入pH值2.0去離子水(乳清濃縮蛋白與pH值2.0去離子水混合體積比為1∶3)，90℃水浴加熱(0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 h)，取樣并4℃冰箱保存。

纖維誘導(dǎo)乳清濃縮蛋白空白樣(纖維空白)：上述制備的2.0%纖維溶液中加入pH值2.0去離子水(纖維與pH值2.0去離子水混合體積比為1∶3)，90℃水浴加熱(0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 h)，取樣并4℃冰箱保存。

1.2.2Th T熒光分析

參照AKKERMANS等[16]的方法并加以改進，用含有0.2 mol/L的NaCl、0.01 mol/L的磷酸緩沖液(pH值7.0)將硫黃素T(Th T)稀釋成質(zhì)量濃度為800 mg/L的溶液。將溶液用0.2 μm的濾膜過濾，除去不溶的Th T顆粒，即得到Th T儲備液。將儲備液置于包有鋁箔的棕色試劑瓶中，4℃冰箱保存。測定時將Th T儲備液用含有0.2 mol/L的NaCl、0.01 mol/L的磷酸緩沖液(pH值7.0)稀釋50倍，即得到Th T工作液；取1 mL樣品加入10 mL的Th T工作液中混勻，然后于熒光分光光度計下比色，在激發(fā)波長為460 nm，發(fā)射波長為490 nm以及狹縫寬度分別為5 nm和10 nm的條件下，測定Th T結(jié)合物的熒光強度。

纖維誘導(dǎo)過程中纖維自身Th T熒光強度也會變化，因此，纖維誘導(dǎo)過程中將去除纖維自身的影響。

纖維誘導(dǎo)乳清濃縮蛋白形成纖維過程中乳清濃縮蛋白的Th T熒光強度計算公式為

T=T1-T2

(1)

式中T1——纖維誘導(dǎo)WPC過程中的Th T熒光強度

T2——纖維熱處理過程中自身的Th T熒光強度

為了保證蛋白終濃度一致，乳清濃縮蛋白自發(fā)形成纖維過程中Th T熒光強度計算公式為

T=T3-T4

(2)

式中T3——WPC自發(fā)形成纖維過程中的Th T熒光強度

T4——WPC熱處理過程中自身的Th T熒光強度

1.2.3蛋白聚合率

取20 mL加熱不同時間(0、1、2、3、5、8、10 h)蛋白質(zhì)量分數(shù)為2.0%的樣品溶液移入45 mL的離心管中，然后在16 000g離心20 min(4℃)，棄去上清液，取離心管底部沉淀，利用凱氏定氮方法測定不同熱處理時間的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。蛋白聚合率計算公式為

C=Ct/C0×100%

(3)

式中C——蛋白聚合率，%

C0——0 h時樣品蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，mg/mL

Ct——t時刻樣品蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，mg/mL

纖維誘導(dǎo)乳清濃縮蛋白形成纖維過程中乳清濃縮蛋白的蛋白聚合率計算公式為

C=C1-C2

(4)

式中C1——纖維誘導(dǎo)WPC過程中的蛋白聚合率

C2——纖維熱處理過程中自身的蛋白聚合率

為了保證蛋白終濃度一致，乳清濃縮蛋白自發(fā)形成纖維過程中蛋白聚合率計算公式為

C=C3-C4

(5)

式中C3——WPC自發(fā)形成纖維過程中的蛋白聚合率

C4——WPC熱處理過程中自身的蛋白聚合率

1.2.4表面疏水性

參照相關(guān)ANS(8-苯氨基-1-奈磺酸)熒光探針法測定[17]，并加以改進。用0.01 mol/L的磷酸緩沖液將不同熱處理時間得到的蛋白溶液質(zhì)量分數(shù)分別稀釋為0.2%、0.1%、0.05%和0.025%。取已稀釋后的蛋白溶液6 mL，加入20 μL的8 mmol/L ANS溶液，漩渦攪拌均勻，在室溫(20℃)下避光15 min，在激發(fā)波長390 nm、發(fā)射波長470 nm和狹縫5 nm的條件下利用熒光分光光度計比色，測定熒光強度，以熒光強度為縱坐標，蛋白質(zhì)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標作圖，初始斜率即為樣品表面疏水性值。

纖維誘導(dǎo)乳清濃縮蛋白形成纖維過程中乳清濃縮蛋白的表面疏水性計算公式為

B=B1-B2

(6)

式中B1——纖維誘導(dǎo)WPC過程中的表面疏水性

B2——纖維熱處理過程中自身的表面疏水性

為了保證蛋白終濃度一致，乳清濃縮蛋白自發(fā)形成纖維過程中表面疏水性計算公式為

B=B3-B4

(7)

式中B3——WPC自發(fā)形成纖維過程中的表面疏水性

B4——WPC熱處理過程中自身的表面疏水性

1.2.5游離巰基

參照BEVARIDG等[18]的方法并加以改善。取400 μL不同熱處理后的樣品(20 mg/mL)，加入至5 mL的Tris-Gly緩沖溶液(0.086 mol/L Tris，0.09 mol/L甘氨酸，0.004 mol/L乙二胺四乙酸，pH值8.0和8 mol/L尿素)中，然后向其中加入20 μL 5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸) (DTNB)試劑，振蕩混勻，室溫下靜止15 min，利用紫外分光光度計在412 nm波長下測定吸光度，以不加DTNB的溶液做空白調(diào)零。游離巰基濃度計算公式為

(8)

式中S——游離巰基濃度，μmoL/L

A412——在412 nm下的吸光度，計算時可用平均值

C′——固形物質(zhì)量濃度，mg/mL

D——稀釋系數(shù)

纖維誘導(dǎo)乳清濃縮蛋白形成纖維過程中，乳清濃縮蛋白的游離巰基濃度計算公式為

S=S1-S2

(9)

式中S1——纖維誘導(dǎo)WPC過程中的游離巰基濃度

S2——纖維熱處理過程中自身的游離巰基濃度

為了保證蛋白終濃度一致，乳清濃縮蛋白自發(fā)形成纖維過程中游離巰基濃度計算公式為

S=S3-S4

(10)

式中S3——WPC自發(fā)形成纖維過程中的游離巰基濃度

S4——WPC熱處理過程中自身的游離巰基濃度

1.2.6起泡性

參照STIEGER等[19]的方法測定蛋白質(zhì)溶液的起泡能力和起泡穩(wěn)定性并加以改進。樣品用0.01 mol/L、pH值7.0的磷酸緩沖液稀釋至0.15%，室溫下用組織搗碎機10 000 r/min均質(zhì)1 min，立即測定攪打后樣品的體積，再測定放置30 min后樣品的體積，通過相對溢出量和靜止后穩(wěn)定的泡沫體積比評價樣品的起泡能力和泡沫穩(wěn)定性，具體計算方法為

E=V0/Vi×100%

(11)

F=Vt/V0×100%

(12)

式中E——相對溢出量，%

F——泡沫穩(wěn)定性，%

V0——起泡0 h時的泡沫體積

Vt——起泡t時間后的泡沫體積

Vi——起泡前最初液體的體積

纖維誘導(dǎo)乳清濃縮蛋白形成纖維過程中乳清濃縮蛋白的相對溢出量、泡沫穩(wěn)定性計算公式為

E=E1-E2

(13)

F=F1-F2

(14)

式中E1、F1——纖維誘導(dǎo)WPC過程中的相對溢出量、泡沫穩(wěn)定性

E2、F2——纖維熱處理過程中自身的相對溢出量、泡沫穩(wěn)定性

為了保證蛋白終濃度一致，乳清濃縮蛋白自發(fā)形成纖維過程中相對溢出量、泡沫穩(wěn)定性計算公式為

E=E3-E4

(15)

F=F3-F4

(16)

式中E3、F3——WPC自發(fā)形成纖維過程中的相對溢出量、泡沫穩(wěn)定性

E4、F4——WPC熱處理過程中自身的相對溢出量、泡沫穩(wěn)定性

1.2.7透射電鏡

參照KREBS等[20]的方法，使用透射電子顯微鏡(TEM)測定樣品的微觀結(jié)構(gòu)。將蛋白溶液質(zhì)量濃度用去離子水稀釋為1 mg/mL，將稀釋液滴于透射電鏡專用銅網(wǎng)上吸附20 min，然后把銅網(wǎng)移入濾紙上并干燥30 min，采用100 kV電壓下用透射電鏡進行分析。

1.2.8統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用Origin 8.6進行作圖和SPSS 16.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行ANOVA方差分析，檢驗差異顯著性(P<0.05)。數(shù)據(jù)均以平均值±標準差表示(n=3)。

2 結(jié)果與討論

2.1 起泡性

2.1.1相對溢出量

本課題組前期研究已得出WPC自發(fā)形成纖維聚合物的起泡能力和起泡穩(wěn)定性是其常規(guī)聚合物的2.40倍和2.00倍[13]。OBOROCEANU等[21]研究也得出同樣的結(jié)果，WPI自發(fā)形成纖維狀聚合物的起泡性和泡沫穩(wěn)定性優(yōu)于WPI常規(guī)聚合物。由圖1可知，纖維誘導(dǎo)的WPC起泡能力遠高于其自發(fā)形成纖維的起泡能力。纖維誘導(dǎo)乳清濃縮蛋白1 h和2 h的起泡能力分別是乳清濃縮蛋白自發(fā)形成纖維的1.36倍和1.41倍。熱處理10 h，纖維誘導(dǎo)WPC起泡能力增量較WPC自發(fā)形成提高了32.35%。其次，在誘導(dǎo)過程中，纖維可以快速提高WPC的起泡能力，尤其在誘導(dǎo)前期(0～2 h)。纖維誘導(dǎo)WPC 2 h起泡能力已經(jīng)略高于WPC自發(fā)形成纖維(10 h)的起泡能力，其變化量占整個誘導(dǎo)過程增量的80%，是WPC自發(fā)熱處理2 h增量的6倍。結(jié)果說明纖維誘導(dǎo)的WPC起泡能力強于WPC自發(fā)形成纖維的起泡能力，并且可短時快速提高WPC的起泡能力。

圖1 WPC與混入纖維的WPC熱處理過程中 起泡能力的變化 Fig.1 Changes of foaming capacity of WPC and WPC mixed fibrils at different heating times

2.1.2泡沫穩(wěn)定性

由圖2可知，纖維誘導(dǎo)的WPC泡沫穩(wěn)定性較WPC自發(fā)形成纖維的泡沫穩(wěn)定性略有提高。但在誘導(dǎo)過程中，纖維仍具有快速提高WPC泡沫穩(wěn)定性的能力(誘導(dǎo)前期0～2 h)；纖維誘導(dǎo)WPC 2 h的泡沫穩(wěn)定性就已高于WPC自發(fā)形成纖維(10 h)的泡沫穩(wěn)定性，其變化量占整個誘導(dǎo)過程增量的79.24%，是WPC自發(fā)熱處理2 h增量的6.11倍。結(jié)果說明混入成熟纖維可快速提高WPC的泡沫穩(wěn)定性。纖維誘導(dǎo)的WPC起泡性高于非誘導(dǎo)情況下WPC自發(fā)形成的起泡性，可能是因為誘導(dǎo)與自發(fā)兩種處理手段導(dǎo)致WPC自組裝聚合形成的纖維能力不同。

圖2 WPC與混入纖維的WPC熱處理過程中泡沫 穩(wěn)定性的變化 Fig.2 Changes of foaming stability of WPC and WPC mixed fibrils at different heating times

2.2 Th T熒光分析

自發(fā)和纖維誘導(dǎo)的WPC在pH值2.0、90℃熱處理條件下，逐漸聚合形成纖維；此過程中β-折疊數(shù)量不斷增加，硫磺素T(Th T)是一種能與疊加的β-折疊特異性結(jié)合的染料，結(jié)合后的熒光強度在一定范圍內(nèi)隨著β-折疊數(shù)量的增加而增強[22]，因此，通常用此方法間接反映纖維形成情況。纖維誘導(dǎo)的WPC在熱處理過程中熒光強度明顯高于WPC自發(fā)形成(圖3a)。在誘導(dǎo)過程中，纖維誘導(dǎo)的WPC熒光強度增量略高于WPC自發(fā)形成，也有文獻得出相同結(jié)果[14,23]。但二者纖維形成速率存在差異(圖3b，圖中不同字母表示組內(nèi)有顯著性差異(P<0.05))。WPC自發(fā)形成纖維過程中熒光強度變化量主要集中在2～5 h內(nèi)；而纖維誘導(dǎo)的WPC熒光強度變化量主要集中在誘導(dǎo)前2 h。纖維誘導(dǎo)WPC 2 h的熒光強度已接近WPC自發(fā)熱處理10 h的熒光強度，其變化量占整個誘導(dǎo)過程增量的80.56%，是WPC自發(fā)熱處理2 h增量的12.04倍。由此結(jié)果可知較WPC自發(fā)形成纖維，成熟纖維的混入可快速誘導(dǎo)WPC形成纖維，縮短纖維形成時間，改善WPC起泡性。

圖3 WPC與混入纖維的WPC熱處理過程中Th T熒光強度的變化 Fig.3 Changes of Th T fluorescence intensity of WPC and WPC mixed fibrils at different heating times

2.3 透射電鏡

纖維誘導(dǎo)WPC與WPC自發(fā)形成纖維過程中其微觀形態(tài)存在差異，微觀形態(tài)差異可反映聚合能力的強弱(圖4)。WPC自發(fā)形成纖維過程中，球形蛋白顆粒不斷聚合形成低聚物，最終在熱處理10 h時形成細長的、有分支的成熟纖維(圖4c)。而纖維誘導(dǎo)2 h時就已形成纖維(無低聚物存在)，纖維形成時間由10 h縮短至2 h。在pH值2.0、90℃熱處理條件下，纖維誘導(dǎo)WPC形成纖維的微觀形態(tài)與WPC自發(fā)形成纖維的微觀形態(tài)無明顯差異，均形成有分支的棒狀結(jié)構(gòu)，但纖維可以加速誘導(dǎo)WPC形成纖維，縮短纖維形成時間。

圖4 WPC與混入纖維的WPC熱處理過程中形成聚合物的透射電鏡圖 Fig.4 Transmission electron micrographs of WPC and WPC mixed fibrils

2.4 蛋白聚合率

為了定量比較纖維誘導(dǎo)和自發(fā)形成纖維過程中形成的WPC纖維量，研究了混入纖維的WPC在熱處理過程中蛋白聚合率(圖5)。由圖可知，纖維誘導(dǎo)的WPC在熱處理過程中蛋白聚合率明顯高于WPC自發(fā)形成。熱處理10 h，纖維誘導(dǎo)的WPC蛋白聚合率變化量較WPC自發(fā)形成提高了33.79%。同時在誘導(dǎo)過程中，纖維誘導(dǎo)WPC 2 h的蛋白聚合率接近WPC自發(fā)熱處理10 h的蛋白聚合率，其變化量占整個誘導(dǎo)過程變化量的69.10%，是WPC自發(fā)熱處理2 h變化量的3.59倍。由此可知較WPC自發(fā)成纖維，混入成熟纖維可以快速誘導(dǎo)WPC形成纖維，并且提高纖維量，從而提高了WPC的起泡性。

圖5 WPC與混入纖維的WPC熱處理過程中 蛋白聚合率的變化 Fig.5 Changes of protein polymerization rate of WPC and WPC mixed fibrils

2.5 聚合驅(qū)動力

蛋白質(zhì)在一定條件下加熱通過某些驅(qū)動力而發(fā)生聚合，這些驅(qū)動力包括共價作用和非共價作用。蛋白質(zhì)在常規(guī)pH值條件下加熱主要通過共價作用(巰基-二硫鍵的交換作用)相互聚合，而在酸性pH值(遠離等電點)條件下加熱，蛋白質(zhì)主要通過疏水作用、氫鍵、范德華力等非共價作用聚合形成纖維狀聚合物。WPC自發(fā)和纖維誘導(dǎo)的WPC聚合過程中主要驅(qū)動力的差異，主要是表面疏水性和游離巰基濃度的變化。纖維誘導(dǎo)的WPC與WPC自發(fā)形成纖維過程中聚合驅(qū)動力的變化趨勢一致，表面疏水性均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(圖6a)。但纖維誘導(dǎo)過程中表面疏水性變化主要集中在誘導(dǎo)0～1 h內(nèi)，其變化量占整個誘導(dǎo)過程增量的74.78%，是WPC自發(fā)形成變化量的1.32倍。纖維誘導(dǎo)的WPC與WPC自發(fā)形成纖維過程中游離巰基含量均緩慢降低[24](圖6b)。但纖維誘導(dǎo)的WPC游離巰基變化量同樣在誘導(dǎo)0～1 h內(nèi)最大，其變化量占整個誘導(dǎo)過程變化量的36.93%，是WPC自發(fā)形成變化量的2.86倍。從以上結(jié)果可知，纖維誘導(dǎo)WPC形成纖維與WPC自發(fā)形成纖維過程中，表面疏水性是主要驅(qū)動力，二硫鍵作用很小[3,25]。同時，較WPC自發(fā)形成纖維，纖維誘導(dǎo)過程中的聚合驅(qū)動力可在短時內(nèi)(0～2 h)快速發(fā)生變化，加速纖維的形成。

圖6 WPC與混入纖維的WPC熱處理過程中聚合驅(qū)動力的變化 Fig.6 Changes of driving aggregation force of WPC and WPC mixed fibrils

3 結(jié)論

(1)與乳清濃縮蛋白自發(fā)形成纖維相比，纖維誘導(dǎo)的乳清濃縮蛋白在熱處理過程中可顯著提高乳清濃縮蛋白的起泡性。

(2)纖維還具有短時快速提高乳清濃縮蛋白起泡性的能力，尤其在誘導(dǎo)前期(0～2 h)。這是因為誘導(dǎo)與自發(fā)兩種處理手段導(dǎo)致乳清濃縮蛋白自組裝聚合形成的纖維能力不同所致。纖維可快速誘導(dǎo)乳清濃縮蛋白形成纖維，縮短纖維形成時間并提高纖維量，從而改善乳清濃縮蛋白的起泡性。