耿飛 陳遠(yuǎn)壽 羅蕓 田丹 盧癸鳳

遵義醫(yī)學(xué)院1生理學(xué)教研室，2病理生理學(xué)教研室（貴州遵義 563000）

低沉的情緒、缺乏動(dòng)機(jī)或希望和快感缺乏是重癥抑郁的常見癥狀［1］。臨床抑郁癥治療的副作用提示需要進(jìn)一步加深對(duì)抑郁行為的理解。之前的研究表明，重癥抑郁和前額葉的紊亂緊密相關(guān)［2］。電刺激內(nèi)側(cè)前額葉可以誘導(dǎo)出抗抑郁樣的行為［3］。而且，激活內(nèi)側(cè)前額葉的興奮性神經(jīng)元可以調(diào)控焦慮抑郁樣行為［4］。絕經(jīng)后抑郁的女性存在突觸傳遞的改變［5］。這些發(fā)現(xiàn)顯示，抑郁可能是內(nèi)側(cè)前額葉的細(xì)胞或者突觸改變所導(dǎo)致的。

在過去20～30年中，分子、細(xì)胞、基因和成像技術(shù)的發(fā)展，讓人們對(duì)包括焦慮、抑郁在內(nèi)的社會(huì)行為有了更深入的理解［6-7］。而基于動(dòng)物行為的研究已經(jīng)成為生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究社會(huì)行為及其神經(jīng)機(jī)制的基礎(chǔ)［8-9］。前額葉及其眾多的交互連接在社會(huì)行為中發(fā)揮了重要的角色［10-11］。

內(nèi)側(cè)前額葉存在不同種類的中間神經(jīng)元，這些中間神經(jīng)元和局部的錐體神經(jīng)元進(jìn)行聯(lián)系。之前的研究［12］表明，用Hm4Di抑制內(nèi)側(cè)前額葉的小清蛋白神經(jīng)元能促進(jìn)無(wú)助行為。之前的研究［13-14］證據(jù)也顯示了抑郁癥和內(nèi)側(cè)前額葉中間神經(jīng)元受損的功能及數(shù)目的減少緊密相關(guān)，因此，前額葉小清蛋白神經(jīng)元可能參與抑郁相關(guān)行為。

為了驗(yàn)證此假說，實(shí)驗(yàn)中選擇性地在內(nèi)側(cè)前額葉小清蛋白神經(jīng)元調(diào)控其活動(dòng)，通過懸尾實(shí)驗(yàn)、糖水偏好實(shí)驗(yàn)及曠場(chǎng)試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)小鼠的抑郁樣行為及運(yùn)動(dòng)能力。本項(xiàng)研究擬明確內(nèi)側(cè)前額葉小清蛋白神經(jīng)元在抑郁行為中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物PV?cre轉(zhuǎn)基因小鼠（7～9周；Jackson Labs，B6；129P2?Pvalbtm1（cre）Arbr/J）被用于此項(xiàng)研究。所有的小鼠在8周齡時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。6只小鼠一籠，12 h的光/暗周期（開燈時(shí)間從早上8：00到下午8：00）。小鼠隨意進(jìn)水進(jìn)食。

1.2 病毒腺相關(guān)病毒5型包裝的病毒，滴度大于2 × 1012/mL。AAV?DIO?ChR2?EGFP和AAV?DIO?EGFP的病毒購(gòu)自上海生博公司。

1.3 方法

1.3.1 立體定位手術(shù)，病毒注射和套管埋置小鼠用氯胺酮（100 mg/kg），去除頭頂毛發(fā)后固定在立體定位儀上。手術(shù)鉆孔開顱，用33?G（Hanmil?ton）的針頭給予0.5μL的AAV5病毒到雙側(cè)的內(nèi)側(cè)前額葉（2，±0.4，-1.5）。10μL漢密爾頓的微量注射器（nanofil；WPI，Sarasota，F(xiàn)L）在微量注射泵（UMP3；WPI，Sarasota，F(xiàn)L）的控制下被用來(lái)注射腺相關(guān)病毒。注射速率0.1μL/min。隨后埋管，比病毒注射位點(diǎn)高0.5 mm（2，0，-1.0），離子水門汀粘合，然后用套管帽封閉套管。行為學(xué)實(shí)驗(yàn)在埋管后的3周進(jìn)行。

1.3.2 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)曠場(chǎng)測(cè)試箱（40 cm×40 cm）分為一個(gè)中央?yún)^(qū)域和外部。單個(gè)小鼠放在外圍的區(qū)域，并且動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)路徑被攝像機(jī)記錄。運(yùn)動(dòng)總距離和在中央?yún)^(qū)域所待時(shí)間通過軟件進(jìn)行分析，運(yùn)動(dòng)軌跡通過上海吉量公司行為軟件分析。

1.3.3 糖水偏好實(shí)驗(yàn)小鼠事先禁水過夜，糖水偏好檢測(cè)箱被用來(lái)檢測(cè)小鼠吸吮糖水或普通水的次數(shù)。糖水的濃度是1%。

1.3.4 懸尾實(shí)驗(yàn)該實(shí)驗(yàn)采用MED Associates懸尾設(shè)備對(duì)小鼠的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。懸尾箱大小為：32 cm×33 cm×33 cm。用膠布制作成小鉤，將4只小鼠尾部（約2 cm處）粘住并懸掛于壓力傳感器處，計(jì)算機(jī)自動(dòng)記錄每只小鼠在每分鐘內(nèi)的累計(jì)不動(dòng)時(shí)間。

1.3.5 腦片準(zhǔn)備小鼠先用乙醚麻醉，迅速的剪斷頸部，在冰凍的人工腦脊液上取出大腦。用震動(dòng)切片機(jī)（VT 1000S；Leica）切下包含內(nèi)側(cè)前額葉的橫切片。切下腦片后，腦片被放置在32℃的記錄液中恢復(fù)活性。所有的溶液都通有95%O2/5%CO2（V/V）的混合氣。

1.3.6 體外膜片鉗電生理記錄腦片被放置在記錄槽內(nèi)，細(xì)胞鉗制在-70 mV。記錄抑制性電流的電極內(nèi)液包含的成分為：140 mmol/L CsCl，2 mmol/L MgCl2，1 mmol/L CaCl2，10 mmol/L EGTA，10 mmol/L HEPES?CsOH，2 mmol/L adenosine triphosphate，5 mmol/L QX?314。記錄興奮性突觸后電流時(shí)的電極內(nèi)液的成分為：130 mmol/L K?gluconate，10 mmol/L NaCl，10 mmol/L Hepes，2 mmol/L MgCl2，1 mmol/L EGTA，0.13 mmol/LCaCl2·2H2O，3.5 mmol/LMg?ATP，1 mmol/L Na?GTP（pH 7.35，285 mOsm）。所有的試劑購(gòu)買自Sigma或Tocris公司。

1.3.7 免疫熒光將小鼠用水合氯醛麻醉，灌注固定的小鼠腦袋用冰凍切片機(jī)進(jìn)行切片，切片厚度25～40μm。腦片首先使用含有0.3%Triton X?100的牛血清白蛋白（BSA）封閉1.5 h，接著4℃孵育小清蛋白一抗（Swant235；1∶1 000）過夜。第2天加入熒光二抗（ALEXA 594?Goat anti Rabbit 1∶800）。室溫避光孵育1 h，封片，熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡下觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0的統(tǒng)計(jì)軟件包處理，多組間比較采用雙因素方差分析，組間兩組比較采取方差分析后的多重比較，取α=0.05為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)側(cè)前額葉攜帶光敏感通道病毒的表達(dá)首先對(duì)PV?cre小鼠的內(nèi)側(cè)前額葉腦區(qū)注射腺相關(guān)病毒5型（AAV5）病毒，該病毒ChR2下游插入增強(qiáng)型的綠色熒光蛋白，不含有光敏感通道的病毒作為對(duì)照病毒。熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)紅色熒光可以和綠色熒光共表達(dá)，而且紅色熒光細(xì)胞多于綠色熒光細(xì)胞（圖1A）。

473 nm藍(lán)光刺激腦片可以記錄到攜帶熒光蛋白的神經(jīng)元的光控誘導(dǎo)電流（圖1B），并且可以隨著頻率的增加（5、10和20 Hz）而穩(wěn)定的誘導(dǎo)（圖1C）。激活內(nèi)側(cè)前額葉帶熒光的神經(jīng)元同樣誘導(dǎo)出動(dòng)作電位，而且也可以隨著頻率的增加（5、10和20 Hz）而穩(wěn)定的誘導(dǎo)出來(lái)（圖1D）。而對(duì)照病毒表達(dá)后，記錄不到這些電生理結(jié)果（未列出）。這些結(jié)果表明了光敏感通道成功表達(dá)于內(nèi)側(cè)前額葉小清蛋白神經(jīng)元。

Fig.1 Expression of ChR2?EGFPvirus in mPFC圖1 內(nèi)側(cè)前額葉中ChR2病毒的表達(dá)

2.2 懸尾實(shí)驗(yàn)為了探索內(nèi)側(cè)前額葉小清蛋白神經(jīng)元在抑郁樣行為中的作用，實(shí)驗(yàn)采用光控遺傳學(xué)手段，通過懸尾實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)小鼠的行為學(xué)效應(yīng)。首先比較了接受光控激活照射小鼠（PV：ChR2）和相應(yīng)的對(duì)照小鼠（PV：EGFP）（圖2A）。激活內(nèi)側(cè)前額葉的小清蛋白神經(jīng)元可以減少懸尾實(shí)驗(yàn)中小鼠的不動(dòng)時(shí)間（圖2B：F=7.37，P=0.015；F=4.68，P=0.046。圖2C：F=12.98，P=0.002 6）。

圖2 興奮內(nèi)側(cè)前額葉小清蛋白神經(jīng)元對(duì)懸尾實(shí)驗(yàn)的影響Fig.2 Effect of excitation of the mPFCparvalbumin neurons in the tail?suspension test

2.3 曠場(chǎng)試驗(yàn)為了排除兩組小鼠之間運(yùn)動(dòng)能力不同所導(dǎo)致的結(jié)果差異，應(yīng)用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)比較了接受光控激活照射小鼠（PV：ChR2）和相應(yīng)的對(duì)照小鼠（PV：EGFP）的運(yùn)動(dòng)能力。結(jié)果顯示，激活內(nèi)側(cè)前額葉的小清蛋白神經(jīng)元對(duì)小鼠的運(yùn)動(dòng)功能并沒有受到影響（F=1.67，P=0.33），兩組小鼠的運(yùn)動(dòng)曲線比較接近。見圖3。

2.4 糖水偏好實(shí)驗(yàn)為了探索內(nèi)側(cè)前額葉小清蛋白神經(jīng)元在糖水偏好中的作用，采用糖水偏好實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)小鼠的行為。90 min的實(shí)驗(yàn)時(shí)程里，中間30 min給予光照（圖4A）。結(jié)果顯示，激活內(nèi)側(cè)前額葉的小清蛋白神經(jīng)元可以增加小鼠的糖水偏好（F=5.35，P=0.039；圖4B）。

圖3 興奮內(nèi)側(cè)前額葉小清蛋白神經(jīng)元對(duì)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的影響Fig.3 Effect of excitation of the mPFCparvalbumin neurons in the open field test

圖4 興奮內(nèi)側(cè)前額葉小清蛋白神經(jīng)元對(duì)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的影響Fig.4 Effect of excitation of the mPFCparvalbumin neurons in the sucrose preference test

3 討論

人的前額葉被分為眶額葉皮層、背外側(cè)前額葉、腹外側(cè)前額葉及內(nèi)側(cè)前額葉，它們參與了眾多的社會(huì)行為過程［15-16］。其中，內(nèi)側(cè)前額葉在人的社會(huì)認(rèn)知等行為中發(fā)揮了關(guān)鍵的角色［17-18］。顯而易見，缺乏內(nèi)側(cè)前額葉或前額葉紊亂會(huì)導(dǎo)致社會(huì)行為受損，產(chǎn)生類似焦慮、抑郁樣等行為疾病［19-20］。

在本研究中，探討了內(nèi)側(cè)前額葉小清蛋白神經(jīng)元在抑郁樣行為中的影響。首先，為了特異性調(diào)控小清蛋白神經(jīng)元的活動(dòng)，實(shí)驗(yàn)中將Cre酶依賴性表達(dá)的攜帶有光敏感通道的病毒表達(dá)在PV?cre轉(zhuǎn)基因小鼠上。體內(nèi)行為學(xué)結(jié)果顯示，激活了小清蛋白神經(jīng)元后小鼠表現(xiàn)為抗抑郁樣效應(yīng)：小鼠在懸尾實(shí)驗(yàn)中掙扎的時(shí)間增加，并且在糖水偏好實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)了更強(qiáng)的糖水偏好。而曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明這些結(jié)果并不是由于不同組間小鼠運(yùn)動(dòng)能力的不同導(dǎo)致的。

免疫熒光結(jié)果顯示，病毒所攜帶的熒光主要表達(dá)在小清蛋白神經(jīng)元上。然而，熒光蛋白的表達(dá)并不能直接證明光敏感通道成功表達(dá)在細(xì)胞膜上。離體腦片光刺激可以記錄到光控誘導(dǎo)電流和動(dòng)作電位，為內(nèi)側(cè)前額葉中光敏感的成功表達(dá)提供直接證據(jù)。因此保證了行為上的可靠性。

激活小鼠內(nèi)側(cè)前額葉小清蛋白神經(jīng)元表現(xiàn)了抗抑郁樣的效應(yīng)，這與之前的文獻(xiàn)報(bào)道是相吻合的。之前的研究發(fā)現(xiàn)，增強(qiáng)錐體神經(jīng)元的興奮性傳遞促進(jìn)無(wú)助行為［21］，這顯示了內(nèi)側(cè)前額葉局部腦區(qū)興奮性和抑制性失去平衡，這可能是由于小清蛋白等中間神經(jīng)元或者錐體神經(jīng)元結(jié)構(gòu)功能的改變所導(dǎo)致。而利用Hm4Di抑制內(nèi)側(cè)前額葉的小清蛋白神經(jīng)元?jiǎng)t更加直接地表明了小清蛋白神經(jīng)元能促進(jìn)無(wú)助行為［12］，當(dāng)然此無(wú)助行為模型與本研究的檢測(cè)方法不同。

皮層小清蛋白神經(jīng)元深刻地影響著錐體神經(jīng)元發(fā)放的時(shí)程及模式，從而參與神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)震蕩的產(chǎn)生和維持［11］。文獻(xiàn)報(bào)道內(nèi)側(cè)前額葉小清蛋白神經(jīng)元在恐懼記憶和防御反應(yīng)［22］等過程中發(fā)揮著重要角色，關(guān)于小清蛋白神經(jīng)元在不同行為中的作用還有待于進(jìn)一步的研究。然而，此研究應(yīng)用新的方法，特異性地調(diào)控局部腦區(qū)的特定神經(jīng)元，從而揭示了內(nèi)側(cè)前額葉小清蛋白神經(jīng)元在抑郁樣行為的作用。

本研究揭示了內(nèi)側(cè)前額葉小清蛋白神經(jīng)元在無(wú)助行為及快感缺乏中的效應(yīng)，從而強(qiáng)烈提示了其參與了抑郁相關(guān)行為的進(jìn)程，而具體的作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步的探討。