周童，楊立飛，夏新宇，肖衡，黃先忠*

（石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，特色植物基因組學(xué)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832003）

植物在生長過程中會受到多種非生物或生物脅迫，如鹽堿、干旱、低溫等非生物脅迫因子都是限制植物生長發(fā)育和作物產(chǎn)量的重要因素，其中土地鹽堿化影響作物的產(chǎn)量、蛋白質(zhì)合成、光合作用以及能量代謝。鹽堿地分布廣泛，目前全球鹽漬土面積高達(dá)10億hm2，在世界干旱和半干旱地區(qū)，約有50%的灌溉土地受到次生鹽堿化影響[1]。我國土地鹽堿化嚴(yán)重，鹽漬化土地約占全球鹽漬面積的1/10，其中有3.6×107hm2的鹽堿地有待開墾利用[2-3]。因此，研究植物抗鹽機(jī)理以培育耐鹽新品種已成為當(dāng)代科學(xué)工作者的重要課題之一。

在高等植物中有多種抗氧化劑，除谷胱甘肽、抗壞血酸，單寧、醌類、黃酮類以外，許多還原酶也發(fā)揮著重要的作用[4]。在鹽脅迫條件下，植物體內(nèi)的活性氧(ROS)會增加，當(dāng)ROS水平超出防御機(jī)制所及范圍，細(xì)胞就將處于氧化脅迫狀態(tài)，引發(fā)脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)氧化、核酸損傷和酶失活，并能激活細(xì)胞程序性死亡[5-6]。近年來發(fā)現(xiàn)的一類碳碳雙鍵還原酶(Alkenal reductase，AER)，被證實(shí)能通過消除在高濃度ROS環(huán)境中產(chǎn)生的α，β-不飽和羰基化合物及丙二醛等有毒親電子羰基化合物（RCs），參與植物在脅迫條件下的解毒過程[7-10]。例如，火炬松PtPPAER基因編碼的雙鍵還原酶通過參與苯基丙酸類的合成在植物防御過程中發(fā)揮作用[11-13]；擬南芥AtAER1通過催化不飽和雙鍵的還原，消除RCs活性α-碳的親電性以有效降低RCs的毒害作用[14]。

小擬南芥是新疆特色短命植物，其比近源種擬南芥更適應(yīng)新疆特殊的高鹽、干旱環(huán)境，是良好的抗逆材料[15-18]。本實(shí)驗(yàn)室前期從小擬南芥（Arabidopsis pumila）中克隆得到一個編碼烯醛雙鍵還原酶基因ApAER，其開放閱讀框長1041 bp，基因表達(dá)分析表明ApAER明顯響應(yīng)高鹽脅迫，說明其應(yīng)對高鹽環(huán)境起著重要作用[19]。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，植物基因工程技術(shù)已成為提高植物抗鹽堿、抗旱、抗寒等性能的重要手段之一。目前，人們已經(jīng)分離、鑒定了一些抗鹽相關(guān)的基因，如擬南芥中的SOS基因家族[20-22]、堿蓬的SsNHX1基因[23]、剛毛檉柳的ThP5CR基因[24]等，并通過轉(zhuǎn)基因手段提高作物的抗鹽能力。本研究通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將ApAER轉(zhuǎn)入煙草，研究轉(zhuǎn)基因煙草在鹽脅迫下的表型和生理指標(biāo)，旨在分析該基因的功能。

1 材料與方法

1.1 材料

本項(xiàng)目用到的小擬南芥、煙草種子，含有花椰菜花葉病毒 (CaMV)的35S啟動子的植物過表達(dá)載體pCAMBIA2300-CaMV35S-OCS，農(nóng)桿菌GV3101菌株均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建過量表達(dá)載體35S：ApAER

將前期測序正確的質(zhì)粒pMD18-T：ApAER[19]用BamH I和KpnI雙酶切，回收目的片段，pCAMBIA2300-CaMV35S-OCS載體經(jīng)同樣的雙酶切回收質(zhì)粒；回收產(chǎn)物經(jīng)T4連接酶連接后，熱激法轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，37℃培養(yǎng)，挑取單克隆提取質(zhì)粒并經(jīng)BamH I和KpnI雙酶切驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的質(zhì)粒即為35S：ApAER；通過熱激法將載體轉(zhuǎn)化至GV3101，用于煙草轉(zhuǎn)化。

1.2.2 煙草的遺傳轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)基因植株的鑒定

將含有35S：ApAER質(zhì)粒的 GV3101通過葉盤法[25]轉(zhuǎn)化到普通煙草(N.tabacumcv.NC89)中。獲得的轉(zhuǎn)基因煙草經(jīng)CTAB法提取葉片組織的DNA，利用ApAER基因的特異引物進(jìn)行PCR檢測。上游引物為 5′-GGGGTACCATGACGGCAACGGCGACGA-3′，下游引物為5′-CGGGATCCTCACTCACGAGCAATAAC AA-3′。反應(yīng)程序?yàn)?94 ℃，2 min，后 94 ℃ 30 s，57 ℃30 s，72 ℃ 50 s，35個循環(huán)后72 ℃延伸 10 min，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 轉(zhuǎn)基因煙草鹽脅迫處理生理指標(biāo)測定

選取陽性T1代轉(zhuǎn)基因及野生型煙草植株，用250 mmol/L 的 NaCl溶液澆透，分別處理 0、2、4 d，每個梯度3個重復(fù)（處理前停止?jié)菜? d）。采用茚三酮法[26]測定游離脯氨酸（proline）的含量，硫代巴比妥酸法（TBA）[27]測量丙二醛（MDA）含量，紫外吸收法[28]測定過氧化氫酶（CAT）活性，愈創(chuàng)木酚法[29]測定過量化物酶（POD）活性。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析使用SPSS 19.0軟件，采用Students't-test進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ApAER基因過量表達(dá)載體的構(gòu)建及煙草植株遺傳轉(zhuǎn)化及鑒定

構(gòu)建了ApAER基因的過表達(dá)載體35S：ApAER，該載體植物中的篩選標(biāo)記基因npt II，賦予細(xì)胞抗卡那霉素能力(圖1A)。將質(zhì)粒35S：ApAER轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，用于煙草的葉盤法轉(zhuǎn)化。侵染后經(jīng)過2-3周的分化培養(yǎng)，煙草的葉盤邊緣開始出現(xiàn)抗性再生芽，待再生苗長至2-4 cm時轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中生根，獲得再生苗。

PCR檢測表明：共有16株轉(zhuǎn)基因煙草植株擴(kuò)增出預(yù)期大小的條帶，非轉(zhuǎn)基因?qū)φ諞]有擴(kuò)增出該片段(圖1B，部分結(jié)果)，證明ApAER基因已成功地轉(zhuǎn)入煙草。將轉(zhuǎn)基因和野生型煙草置于250 mmol/L NaCl脅迫培養(yǎng)14 d，在長期高鹽脅迫環(huán)境中，轉(zhuǎn)基因煙草較普通煙草，生長速度更快，植株高、葉片大、葉色更深（圖 1C）。

圖1 ApAER基因過量表達(dá)載體的構(gòu)建及煙草的遺傳轉(zhuǎn)化Fig.1 Construction of the overexpression vector ofApAERgene and the genetic transformation of tobacco

2.2 轉(zhuǎn)基因煙草生理指標(biāo)測定結(jié)果

2.2.1 Proline含量的變化

圖2A顯示：

（1）鹽脅迫下野生型煙草與轉(zhuǎn)基因煙草中proline的含量均增加，但轉(zhuǎn)ApAER基因的煙草植株proline含量增幅遠(yuǎn)大于對照。

（2）轉(zhuǎn)基因煙草鹽脅迫2 d和4 d時，proline含量分別是未脅迫的3.8倍和5.8倍，而非轉(zhuǎn)基因煙草為未脅迫的2.9倍和3.4倍。轉(zhuǎn)基因煙草與對照組煙草在鹽脅迫2 d時，proline含量即存在顯著差異（P＜0.05），4 d時更是達(dá)到極顯著差異（P＜0.01）。同時在鹽脅迫2 d和4 d下，轉(zhuǎn)基因煙草proline含量分別是非轉(zhuǎn)基因煙草的2.8倍和3.6倍。

（3）上述結(jié)果說明轉(zhuǎn)基因煙草較野生型煙草有更強(qiáng)的耐鹽性。

2.2.2 鹽脅迫對煙草MDA含量的影響

由圖2B可知：

（1）鹽脅迫下對照組煙草和轉(zhuǎn)基因煙草的MDA含量在總體上均呈上升的趨勢，但轉(zhuǎn)基因煙草MDA總含量及增幅均較非轉(zhuǎn)基因煙草更低。轉(zhuǎn)基因煙草與野生型煙草在脅迫2 d時，MDA含量分別為其未脅迫對照的0.98倍和1.19倍，說明轉(zhuǎn)基因植株在短時間鹽脅迫下明顯具有更強(qiáng)的抗性。

（2）轉(zhuǎn)基因煙草MDA含量在0 d和4 d時與非轉(zhuǎn)基因煙草MDA含量均存在顯著差異（P＜0.05），且2 d時存在極顯著差異（P＜0.01）。同時野生型煙草在2 d和4 d鹽脅迫下MDA含量分別是轉(zhuǎn)基因煙草的1.6倍和1.2倍，也說明轉(zhuǎn)基因煙草通過降低其自身MDA含量，使其對鹽脅迫有更強(qiáng)的抗性。

（3）鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因和野生型煙草葉片MDA含量均呈上升趨勢，表明轉(zhuǎn)基因和野生型煙草在鹽脅迫下質(zhì)膜均出現(xiàn)過氧化損害，但轉(zhuǎn)基因煙草均較對照含量低且增幅小，說明轉(zhuǎn)基因煙草膜脂氧化程度更低，即對鹽脅迫有更強(qiáng)抗性。

2.2.3 鹽脅迫對煙草CAT活性的影響

圖2C顯示：

在2 d和4 d的鹽脅迫下，野生型煙草和轉(zhuǎn)基因煙草CAT活性均呈先升后降的趨勢，但轉(zhuǎn)基因煙草CAT酶活性始終較野生型煙草更高。其中在2 d和4 d鹽脅迫下，轉(zhuǎn)基因煙草CAT的酶活性分別是普通煙草的1.17倍和1.24倍，但差異不顯著；同時在4 d鹽脅迫下，轉(zhuǎn)基因煙草的酶活力比未脅迫轉(zhuǎn)基因煙草高，而普通煙草較未脅迫野生型煙草更低?？梢娹D(zhuǎn)基因煙草抗鹽能力更強(qiáng)，說明ApAER基因能提高轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽能力。

2.2.4 鹽脅迫對煙草POD活性的影響

由圖2D可知：

在無脅迫情況下，POD活性也與對照組煙草有明顯差異，且酶活力為對照的2.47倍。鹽脅迫處理下兩種煙草的POD活性都呈先減少再增加的趨勢，但轉(zhuǎn)ApAER基因煙草的POD活性始終高于普通煙草（圖2D）。2 d和4 d鹽脅迫下，轉(zhuǎn)基因煙草POD活性分別是野生型煙草活性的2.22倍和1.43倍，并且鹽脅迫2d時POD含量存在顯著差異（P＜0.05）。研究表明轉(zhuǎn)基因煙草較野生型煙草POD酶活力更強(qiáng)，即其對活性氧及自由基有更強(qiáng)的清除能力，說明ApAER基因能增強(qiáng)植株對鹽的抗性。

圖2 250 mM NaCl脅迫不同時間35S：ApAER轉(zhuǎn)基因煙草及對照(WT)中生理指標(biāo)的變化分析Fig.2 Changes of physiological indexes in35S：ApAERtransgenic tobaccos and control(WT)under 250 mM NaCl stress at different time

3 討論

烯醛類物質(zhì)對生物有一定毒性，如癸二烯醛能顯著抑制浮游植物的生長及光合作用[30]。火炬樹的PtPPAER基因所編碼的雙鍵還原酶，能夠催化降解4-羥基-(2E)-壬烯醛等具有烯醛官能團(tuán)的有毒底物，對植物防御和抗逆具有重要價值[11]。青蒿α，β-雙鍵還原酶(AaAER)基因的表達(dá)水平響應(yīng)干旱脅迫及植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)誘導(dǎo)，并且與青蒿素含量呈正相關(guān)，表明該雙鍵還原酶基因?qū)η噍镯憫?yīng)逆境脅迫有重要作用[31]。

本研究發(fā)現(xiàn)：在鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草植的各項(xiàng)抗性生理指標(biāo)均較非轉(zhuǎn)基因煙草植株更高。植物中MDA含量增加，破壞膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致膜透性增加，最終對細(xì)胞造成損傷甚至導(dǎo)致死亡，因而被作為植物受損的重要指標(biāo)[32]。轉(zhuǎn)基因煙草的MDA含量在各脅迫時間段均比非轉(zhuǎn)基因煙草顯著更低，表明轉(zhuǎn)基因煙草在同等鹽脅迫強(qiáng)度下，細(xì)胞質(zhì)膜過氧化水平更低，細(xì)胞質(zhì)膜更加穩(wěn)定，相關(guān)生化反應(yīng)能更穩(wěn)定地進(jìn)行，且其清除自身活性氧的能力更高，因而被賦予了更強(qiáng)的抗鹽能力；也說明ApAER能減少鹽脅迫下植物中諸如MDA的，具有烯醛官能團(tuán)的化合物，以提高植物對鹽的抗性，這很可能是轉(zhuǎn)基因煙草抗鹽能力得到顯著增強(qiáng)的主要原因之一。

游離proline是植物體內(nèi)最重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一，在植物通過滲透調(diào)節(jié)以適應(yīng)逆境脅迫方面具有非常重要的作用[33]。轉(zhuǎn)基因煙草在高鹽脅迫下proline含量明顯提高，而高含量的proline除具有清除活性氧的功能外，還可以憑借其偶極性，使其疏水端和親水端分別與蛋白質(zhì)和水分子結(jié)合，從而有效防止蛋白質(zhì)脫水引發(fā)酶和蛋白質(zhì)的變性，以維持細(xì)胞正常生理活動，進(jìn)而提高煙草抗鹽能力。這也可能是轉(zhuǎn)基因煙草抗鹽能力得到顯著提高的另一重要原因。

主要存在于細(xì)胞過氧化物酶體和乙醛酸循環(huán)體中的CAT能催化H2O2分解成O2和H2O，從而使細(xì)胞免于遭受H2O2的毒害，是生物防御體系的關(guān)鍵酶之一[34]。本研究中，在4 d的鹽脅迫中煙草中的CAT活性呈先增加后減少的趨勢，鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草的CAT活性要高于非轉(zhuǎn)基因煙草。POD也是植物體內(nèi)擔(dān)負(fù)清除H2O2的主要酶類之一，能夠催化H2O2氧化產(chǎn)生H2O，以降低膜內(nèi)不飽和脂肪酸的過氧化程度，維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定和完整，從而顯著提高植物耐鹽性。在0-4 d的鹽脅迫下，POD活性呈現(xiàn)先減少后增加的趨勢，其中在0 d和2 d鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草的POD活性均顯著高于非轉(zhuǎn)基因煙草，說明轉(zhuǎn)基因煙草能提高CAT和POD等還原酶活性，使其對H2O2等氧化劑有更強(qiáng)的清除能力，進(jìn)而維持細(xì)胞膜穩(wěn)定，增強(qiáng)對逆境的抗性。

4 結(jié)論

煙草中過表達(dá)小擬南芥ApAER基因，能夠通過提高植物清除細(xì)胞中醛自由基的能力，參與植物在鹽脅迫下的解毒過程，并且提高proline等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量和相關(guān)還原酶的活性，進(jìn)而顯著提高轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性。研究結(jié)果與ApAER基因響應(yīng)鹽等非生物脅迫上調(diào)表達(dá)的結(jié)果相符[19]。本研究為解析植物抗鹽機(jī)理和開發(fā)相關(guān)抗鹽基因及培育抗鹽作物提供了基礎(chǔ)與支持。