張鵬飛，劉戈輝，郭文婷，張薇*

（新疆綠州農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆 石河子 832003）

棉花作為重要的經(jīng)濟(jì)作物，在我國(guó)經(jīng)濟(jì)發(fā)展中占有重要地位。棉花枯萎病是由尖孢鐮刀菌引起的一種土傳性病害，是影響棉花產(chǎn)量及品質(zhì)的重要病害。培養(yǎng)抗病品種是防治棉花枯萎病最經(jīng)濟(jì)有效的措施，而抗病基因的挖掘?qū)槔蒙锛夹g(shù)創(chuàng)制棉花抗病種質(zhì)和培育抗病品種奠定基礎(chǔ)[1]。

植物在長(zhǎng)期進(jìn)化的過(guò)程中，形成了一系列機(jī)制以適應(yīng)和抵御各種生物和非生物逆境。當(dāng)植物受到外界環(huán)境信號(hào)刺激時(shí)，基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)在應(yīng)答的眾多過(guò)程中具有重要作用[2]。植物特有的WRKY蛋白類轉(zhuǎn)錄因子家族是一種鋅指型轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，其結(jié)構(gòu)域由約六十個(gè)氨基酸組成，氨基末端附近有WRKYGQK保守氨基酸殘基及鋅指結(jié)構(gòu)[3]。WRKYGQK作為WRKY結(jié)構(gòu)域的核心序列具有重要作用，它的改變可能導(dǎo)致結(jié)構(gòu)域結(jié)合DNA的活性減弱或喪失[4]。WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子廣泛的參與植物的抗病防衛(wèi)反應(yīng)，當(dāng)植物受到外界信號(hào)刺激后，促使WRKY蛋白誘導(dǎo)目標(biāo)基因的表達(dá)，誘導(dǎo)方式表現(xiàn)為該蛋白與啟動(dòng)子區(qū)W-box作用元件進(jìn)行結(jié)合，這種誘導(dǎo)通常可以被WRKY蛋白自我調(diào)節(jié)或被幾個(gè)不同的WRKY蛋白交叉調(diào)控[5]。在各種植物中有大量的WRKY家族成員目前相繼被發(fā)現(xiàn)，水稻中包括約100個(gè)成員[6]，大豆中則高達(dá) 197個(gè)[7]，在擬南芥中共有74個(gè)WRKY基因家族成員，這些基因主要參與植物抵抗逆境和衰老等生理過(guò)程[8]。擬南芥在過(guò)表達(dá)AtWRKY38及AtWRKY62后，降低了植株的抗病性[9-10]。擬南芥中過(guò)表達(dá)WRKY33基因響應(yīng)病原菌誘導(dǎo)，激活植株抗病反應(yīng)，使植株抗病能力提升[11-13]。李靜等[14]研究海島棉GbWRKY53基因在受到黃萎病菌誘導(dǎo)后，基因表達(dá)量呈現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢(shì)，其表達(dá)量隨著植株體內(nèi)病菌的不斷變化做出相應(yīng)調(diào)整。有研究報(bào)道，在黃萎病菌誘導(dǎo)后，海島棉WRKY103基因表達(dá)量明顯降低，而WRKY46在高抗黃萎病的海島棉中的表達(dá)量變化明顯高于陸地棉[15]，在植物的抗病反應(yīng)中WRKY基因的作用非常重要。

目前抗性相關(guān)的WRKY基因報(bào)道較多，但在棉花中的報(bào)道尚且不足，仍有許多抗病相關(guān)WRKY基因有待發(fā)掘。本研究以枯萎病菌誘導(dǎo)后棉花基因表達(dá)譜中差異表達(dá)的WRKY基因片段為探針序列，從陸地棉中克隆目的基因，并對(duì)目的基因編碼蛋白的理化性質(zhì)、氨基酸組成、結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)等進(jìn)行分析，在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建該基因的過(guò)表達(dá)載體，為該基因的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

由石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院作物遺傳育種教研室提供陸地棉高抗枯萎病品種‘中棉所12’。

主要試劑有植物總RNA小量抽提試劑盒購(gòu)于Magen公司，EasyScript One-Step gDNA Removal反轉(zhuǎn)錄試劑盒和Trans5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞均購(gòu)于全式金生物公司，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)于天根公司，PMD19-T Vector Cloning Kit購(gòu)于TaKaRa公司，其他藥品均為國(guó)產(chǎn)分析純。

主要儀器有培養(yǎng)箱、－80℃超低溫冰箱、移液槍、PCR擴(kuò)增儀、凝膠電泳儀、凝膠紫外成像儀、超凈工作臺(tái)、核酸測(cè)定儀、搖床等。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

挑選適量經(jīng)過(guò)濃硫酸脫絨后籽粒飽滿的棉花種子，10%過(guò)氧化氫溶液浸泡3h進(jìn)行消毒處理后，用無(wú)菌水沖洗4-5遍，進(jìn)行催芽至種子露白。在無(wú)菌的蛭石中種植種子，培養(yǎng)棉苗真葉生長(zhǎng)至3片時(shí)，液氮冷擊提取的植株根部組織樣品，放置于超低溫冰箱-80℃儲(chǔ)藏備用。

1.2.2 棉花GhWRKY75基因的克隆和序列分析

以枯萎病菌誘導(dǎo)后棉花基因表達(dá)譜中差異表達(dá)的WRKY基因?yàn)樘结?，在棉花的?shù)據(jù)庫(kù)中，利用Blastn比對(duì)分析、CAP3拼接EST序列等一系列電子克隆技術(shù)，從陸地棉中篩選得到WRKY75轉(zhuǎn)錄因子基因，在軟件COTTONGEN和ORF Finder中進(jìn)一步分析，選擇ORF完整的序列，利用Primer Premier 5軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)（引物的序列為F1：GGGGTACCATGTTTCTTCCCGTCTCT；R1：GCTCTAGAAAAGGGTGTGTAAATTTGCAT）。

采用試劑盒提取棉花根部總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠的電泳檢測(cè)，對(duì)預(yù)期大小的目的片段進(jìn)行膠回收，將回收的目的片段和克隆載體PMD19-T過(guò)夜連接，連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans5α感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)藍(lán)白斑的篩查選擇，用菌液PCR和雙酶切驗(yàn)證篩選其陽(yáng)性克隆，送北京華大公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 棉花GhWRKY75基因的生物信息學(xué)分析

GhWRKY75同源進(jìn)化分析和蛋白基序分析：在CD-search （https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）分析目的基因保守域，在NCBI搜索其他物種的WRKY基因，下載與之同源性較高的序列，利用MEGA 5.05軟件進(jìn)行同源進(jìn)化樹(shù)的分析；利用DNAMAN V6軟件進(jìn)行多重序列的比對(duì)。

基因編碼蛋白性質(zhì)和蛋白結(jié)構(gòu)分析：利用ExPASy ProtParam（https：//web.expasy.org/cgi-bin/protparam）對(duì)蛋白的理化性質(zhì)和蛋白的親/疏水性進(jìn)行分析；利用 GOR4(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl page=npsa_gor4.html)對(duì)該基因的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，利用 SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/interactive）對(duì)該基因的三級(jí)蛋白結(jié)構(gòu)建模，利用 NetPhos 3.1 Server(http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos-2.0/)進(jìn)行蛋白的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)。

1.2.4 GhWRKY75基因過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建

將植物過(guò)表達(dá)載體pCAMBIA2300-35S-OCS和克隆載體p MD19-T-GhWRKY75用限制性內(nèi)切酶KpnΙ和XbaΙ進(jìn)行雙酶切，1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)酶切的結(jié)果，采用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行目的基因片段和表達(dá)載體大片段的回收產(chǎn)物連接后熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans5α感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行菌液PCR和雙酶切驗(yàn)證后保菌，于-80℃冰箱儲(chǔ)藏備用。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉花GhWRKY75基因的克隆及序列分析

以棉花品種‘中棉所12’的根部cDNA作為模板，根據(jù)設(shè)計(jì)的全長(zhǎng)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到一條500 bp左右的擴(kuò)增產(chǎn)物（圖1A），回收目的片段與PMD19-T載體連接，雙酶切驗(yàn)證后（圖1B），對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示，該序列的ORF全長(zhǎng)是513 bp，與電子拼接序列一致，編碼170個(gè)氨基酸，含有一個(gè)終止密碼子（圖2）。

圖1 GhWRKY75基因 PCR 擴(kuò)增（A）和雙酶切驗(yàn)證（B）Fig.1 PCR amplification（A）and double enzyme digestion verification（B）ofGhWRKY75

圖2 GhWRKY75基因的核苷酸序列及推定的氨基酸序列Fig.2 The nucleotide sequence and amino acid sequence ofGhWRKY75gene

2.2 生物信息學(xué)分析

2.2.1 GhWRKY75同源進(jìn)化樹(shù)分析和多重序列比對(duì)

在相關(guān)分析軟件NCBI中搜索并下載了20個(gè)已知的WRKY同源基因的堿基序列及氨基酸序列，利用MEGA 5.05軟件進(jìn)行同源基因進(jìn)化樹(shù)分析（圖3），結(jié)果顯示，該基因與雷蒙德氏棉Gossypium raimondii（XM_012598374.1）的轉(zhuǎn)錄因子聚在一起，說(shuō)明其親緣關(guān)系最近。

利用DNAMAN V6軟件進(jìn)行同源基因的多重序列的比對(duì)（圖4），結(jié)果顯示，該基因含有一個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域的核心序列WRKYGQK，位于第97～103個(gè)氨基酸位置，具有1個(gè)典型的C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)，屬于第Ⅱ類WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子。

圖3 GhWRKY75與同源基因的氨基酸序列的進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Evolutionary tree of amino acid sequence ofGhWRKY75and homologous genes

圖4 同源基因不同植物的氨基酸序列比對(duì)Fig.4 Amino acid sequence alignment of different plant homologous genes

2.2.2 GhWRKY75基因編碼的蛋白分析和蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

采用ProtParam軟件對(duì)GhWRKY75基因編碼蛋白的氨基酸序列進(jìn)行在線分析，結(jié)果顯示，該基因編碼的蛋白總原子數(shù)為2715，分子量為19.51 kD，分子式為C857H1344N246O260S8，是由170個(gè)氨基酸組成，帶有正電荷的（Arg+Lys）氨基酸殘基總數(shù)為25，帶有負(fù)電荷的（Asp+Glu）氨基酸殘基總數(shù)是 18，理論等電點(diǎn)是 9.30，蛋白的不穩(wěn)定性指數(shù)（II）為 32.05，該蛋白為穩(wěn)定蛋白，脂肪指數(shù)是60.12，該蛋白親水性平均值為-0.831，屬于疏水性蛋白。利用在線的生物信息學(xué)相關(guān)分析軟件GOR4對(duì)該基因的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，由α螺旋、延伸鏈和無(wú)規(guī)則卷曲3種主要元件組成，其中α螺旋包含了26個(gè)氨基酸，約占15.29%，延伸鏈包含了40個(gè)氨基酸，約占23.53%，無(wú)規(guī)則卷曲包含了個(gè)104氨基酸，約占61.18%，二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要組成部分為無(wú)規(guī)則卷曲。

利用SWISS-MODEL在線軟件對(duì)GhWRKY75基因編碼蛋白和AtWRKY75基因編碼蛋白進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)（圖5），發(fā)現(xiàn)該基因編碼蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)與AtWRKY75基因編碼蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)類似，推測(cè)該基因可能與AtWRKY75基因的功能相似。

圖5 三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)GhWRKY75和AtWRKY75的編碼蛋白Fig.5 The tertiary structure predicts the encoded proteins of GhWRKY75 and AtWRKY75

利用NetPhos 3.1 Server在線軟件對(duì)GhWRKY75的蛋白磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示（圖6），其主要包含有 7個(gè)蘇氨酸（Threonine）、18個(gè)絲氨酸（Serine）和 23個(gè)酪氨酸（Tyrosine）磷酸化位點(diǎn)，由此推測(cè)GhWRKY75蛋白活性的調(diào)控可能與磷酸化作用有關(guān)。

圖6 GhWRKY75蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig.6 Protein phosphorylation sites prediction ofGhWRKY75

2.3 GhWRKY75基因的過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建

將克隆載體pMD19-T-GhWRKY75用限制性內(nèi)切酶KpnΙ和XbaΙ進(jìn)行雙酶切，得到513 bp的基因片段，把該片段與經(jīng)過(guò)雙酶切獲得的pCAMBIA2300-35S-OCS大片段進(jìn)行連接，構(gòu)建35 S：：GhWRKY75過(guò)表達(dá)載體。在雙酶切鑒定后，產(chǎn)生了和預(yù)期片段大小一致的兩條片段（圖7），說(shuō)明已經(jīng)成功構(gòu)建了植物的過(guò)表達(dá)載體。

圖7 pCAMBIA2300-35S-GhWRKY75的酶切驗(yàn)證Fig.7 Enzymatic digestion verification of pCAMBIA2300-35S-GhWRKY75

3 討論

近幾年來(lái)發(fā)展起來(lái)的電子克隆是一項(xiàng)快速克隆基因的技術(shù)，利用生物信息學(xué)技術(shù)得到各功能基因序列的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步結(jié)合RT-PCR等方法對(duì)基因進(jìn)行克隆分析、驗(yàn)證，電子克隆已經(jīng)成為現(xiàn)在實(shí)用的一種基因獲得的途徑[16-17]。目前抗性相關(guān)的WRKY基因報(bào)道較多，但在棉花中的報(bào)道尚且不足，本研究前期以枯萎病菌誘導(dǎo)后棉花基因表達(dá)譜中差異表達(dá)的WRKY基因片段為探針序列，在棉花的數(shù)據(jù)庫(kù)中，利用比對(duì)分析、序列拼接等一系列電子克隆技術(shù)，篩選得到WRKY75轉(zhuǎn)錄因子。對(duì)克隆得到的GhWRKY75基因進(jìn)行序列分析，該基因編碼170個(gè)氨基酸，其WRKY結(jié)構(gòu)域的核心序列WRKYGQK位于第97-103個(gè)氨基酸位置，具有典型的C2H2鋅指結(jié)構(gòu)，屬于第Ⅱ類WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子。萬(wàn)永青等克隆灌木中間錦雞兒WRKY75基因，對(duì)基因序列分析，含有1個(gè)保守WRKYGQK序列和1個(gè)C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)，屬于第Ⅱ類WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子[18]，與本研究克隆得到的棉花WRKY75基因?qū)儆谕怶RKY家族。Xu等研究發(fā)現(xiàn)擬南芥AtWRKY75基因響應(yīng)多種病菌的誘導(dǎo)[19]，本研究對(duì)棉花GhWRKY75基因編碼蛋白進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)該基因的編碼蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)與擬南芥AtWRKY75基因的編碼蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)類似度較高，預(yù)測(cè)GhWRKY75可能也與抗病相關(guān)。此外，棉花GhWRKY75基因和擬南芥AtWRKY75基因的序列對(duì)比中顯示，棉花中富含賴氨酸、蘇氨酸和谷氨酰胺，但擬南芥中絲氨酸、賴氨酸和谷氨酰胺含量較多。

復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)存在于植物的各種生理生化反應(yīng)過(guò)程中，包括生長(zhǎng)發(fā)育、對(duì)外界環(huán)境生物及非生物刺激的應(yīng)答等，其中轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮的作用十分重要[20]。近年來(lái)，人們對(duì)WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族基因的研究取得了一定進(jìn)展，枯萎病菌誘導(dǎo)后Gh WRKY44和GhWRKY22基因在抗病品種中優(yōu)勢(shì)表達(dá)，基因表達(dá)量明顯高于感病品種，對(duì)于病原菌的響應(yīng)時(shí)間要早于感病品種[21]，但棉花中仍有許多與抗病相關(guān)的WRKY基因未被報(bào)道。作為一類重要的轉(zhuǎn)錄因子，本研究已經(jīng)完成了對(duì)該基因的克隆、序列和蛋白的分析以及表達(dá)載體的構(gòu)建，使該基因在植物中表達(dá)有了一定基礎(chǔ)，對(duì)進(jìn)一步研究基因的功能提供參考依據(jù)。