荊明龍，李敏，王小鳳，李明奇，霍鳳嬌，張?jiān)?，劉良波，張靜，張輝*

（石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832000）

布魯氏菌是一種短桿狀革蘭氏陰性胞內(nèi)寄生菌，宿主細(xì)胞為巨噬細(xì)胞或胚胎滋養(yǎng)層[1]，可以廣泛引起人和哺乳動(dòng)物睪丸炎、附睪炎、流產(chǎn)等疾病，給畜牧業(yè)發(fā)展造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。布魯氏菌通過細(xì)胞膜的脂筏(Lipid rafts)進(jìn)入宿主細(xì)胞[2]，形成布氏小體，布氏小體酸化，避免被溶酶體殺傷，在胞內(nèi)生存[3-4]。布魯氏菌的感染會(huì)引起宿主體內(nèi)廣泛的病理變化，布魯氏菌會(huì)隨著巨噬細(xì)胞在循環(huán)系統(tǒng)的循環(huán)而滯留在肝、脾、骨髓、淋巴結(jié)等處，進(jìn)而引起這些器官的炎癥反應(yīng)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明NF-κB在炎癥相關(guān)的腫瘤發(fā)展中發(fā)揮重要作用[5-6]，其過度表達(dá)會(huì)導(dǎo)致機(jī)體炎癥反應(yīng)及組織病理損傷。

核轉(zhuǎn)錄因子kapaB(NF-κB)是近年發(fā)現(xiàn)的與多種炎性因子調(diào)控相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。NF-κB家族包括NF-κB1(P50)、NF-κB2(P52)、RelA(P65)、RelB 和c-Rel 5個(gè)成員[7]。靜息狀態(tài)下NF-κB以同源或異源二聚體形式存在，與iκB結(jié)合并存在于胞漿中[8]。參與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)，當(dāng)細(xì)胞受到刺激后，NF-κB可被活化，迅速由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，與DNA的靶向相關(guān)序列相結(jié)合，調(diào)節(jié)相應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄是一種急性期蛋白的基因轉(zhuǎn)錄[9]。不同的NF-κB成員相互結(jié)合成不同同源或異源二聚體，其中最重要的是p50/p65異源二聚體，因此被稱為通常所說的NF-κB[10]。

本實(shí)驗(yàn)采用的LipofectamineTM 2000陽離子脂質(zhì)體將siRNA和shRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)RAW264.7細(xì)胞，使用實(shí)時(shí)熒光定量的方法檢測(cè)NF-κB P65相對(duì)表達(dá)量。篩選干擾效率較高的靶向小鼠P65基因的小干擾RNA，并利用慢病毒表達(dá)載體pLL3.7-shRNA系統(tǒng)，構(gòu)建可在RAW264.7細(xì)胞中表達(dá)相應(yīng)NF-κB P65 shRNA的慢病毒，以期為進(jìn)一步研究沉默P65對(duì)NF-κB產(chǎn)生炎癥影響奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠 RAW264.7巨噬細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。

Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen公司；RT-PCR試劑盒、DNA Marker均購(gòu)自TAKARA 公司；Taq Master Mix購(gòu)自百泰克公司；三氯甲烷、乙醇、異丙醇等均購(gòu)自上海生物工程技術(shù)有限公司；瓊脂糖購(gòu)自北京康為世紀(jì)；DMEM 和胎牛血清均購(gòu)自 Gibco公司。熒光染料購(gòu)自羅氏Roche公司。

微量移液器(eppendorf)；微量紫外分光光度計(jì)；水浴鍋(DKB-501A)；高速冷凍離心機(jī)(Sigma，2-16k)；全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌罐；恒溫培養(yǎng)箱(DNP-9162)；UVP凝膠成像儀；PCR儀 (BIO-RAD)；超凈工作臺(tái)；低溫冰箱；電泳儀；電子稱 (Sartorius group，Acculab ALC1100.2)；生物安全柜(Esco，ClassⅡbiohazard safe cabinet)；倒置顯微鏡；恒溫 CO2培養(yǎng)箱；渦旋振蕩器。

1.2 方法

1.2.1 布魯氏菌侵染RAW264.7對(duì) NF-κB P65的表達(dá)情況

在生物安全柜中接種陽性2308布魯氏菌液于20 mL高壓滅菌過的的布魯氏菌液體培養(yǎng)基中，置于 37℃、180 r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)細(xì)菌生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期備用。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期生長(zhǎng)良好的RAW264.7細(xì)胞進(jìn)行鋪板，設(shè)置分組為布魯氏菌侵染組和陰性對(duì)照組，每組3個(gè)重復(fù)。通過麥?zhǔn)媳葷峁軐?duì)已經(jīng)活化的2308布魯氏菌進(jìn)行比濁。利用麥?zhǔn)媳葷峁苡?jì)算的數(shù)量，按照感染復(fù)數(shù)MOI(細(xì)菌數(shù)：細(xì)胞數(shù))100：1的比例侵染實(shí)驗(yàn)組，加入等量的PBS作為陰性對(duì)照，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞在5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)，侵染1 h后每孔加入2.5 μL/mL的硫酸慶大霉素作用45 min后換新鮮培養(yǎng)液，開始計(jì)時(shí)，24 h后使用Trizol裂解細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)或置于-80℃冰箱冷凍保存。

按照RNA提取試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA，并用核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定RNA的濃度及純度。然后按照康為世紀(jì)反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20℃保存，熒光定量檢測(cè)布魯氏菌侵染RAW264.7細(xì)胞中NF-κB P65的相對(duì)表達(dá)情況。

1.2.2 siRNA的設(shè)計(jì)與篩選

1.2.2.1 N F-κB P65 siRN A的設(shè)計(jì)

根據(jù) NCBI上公布的小鼠RAW264.7 NF-κB P65(NC_000085.6)的mRNA序列，根據(jù)siRNA設(shè)計(jì)原則，由上海吉瑪公司合成（表1）。

表1 RAW264.7細(xì)胞P65siRNA干擾序列Tab.1 P65siRNA interference sequence of RAW264.7 cells

1.2.2.2 有效siRN A的篩選

在六孔培養(yǎng)板中，每孔鋪入5×105個(gè)RAW264.7細(xì)胞，24 h后換為無血清無抗生素的培養(yǎng)基，并進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)按照Invitrogen Lipofectamine2000說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染分為組：空白對(duì)照組，NC-FAM對(duì)照組，NC組，3組 P65 siRNA組。各組 siRNA 10 μL，與 Opti-MEM 240 μL 混合，Lipofectamine 2000 7 μL 與 Opti-MEM 243 μL 混合，室溫靜置5 min后兩者混合再靜置20 min。加入對(duì)應(yīng)組孔的培養(yǎng)液中，siRNA的終濃度為100 nM。放入電熱恒溫培養(yǎng)箱，37℃，5%CO2，完全濕度，6小時(shí)后，換為含血清的培養(yǎng)液。記為轉(zhuǎn)染0 h，在轉(zhuǎn)染12 h后，熒光顯微鏡對(duì)Negative control FAM組熒光觀察?；罨牟剪斒暇?，MOI(細(xì)胞數(shù)：細(xì)菌數(shù))按照1∶100侵染其他各組細(xì)胞60 min，PBS清洗，50單位慶大霉素每孔殺死胞外菌，PBS清洗，更換新鮮培養(yǎng)液，記為侵染0 h。在侵染24 h后，棄去上清培養(yǎng)液，Trizol裂解細(xì)胞，使用RNA提取試劑盒提取RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA，進(jìn)行熒光定量實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 pLL3.7真核重組表達(dá)載體的構(gòu)建

篩選相對(duì)表達(dá)量較高的siRNA，根據(jù)siRNA片段設(shè)計(jì)shRNA干擾序列并合成(表2)。寡聚的核苷酸單鏈退火合成DNA雙鏈模板。將pLL3.7載體使用限制性內(nèi)切酶HpaⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行膠回收。雙鏈shRNA與線性化pLL3.7載體進(jìn)行16℃過夜連接，將連接產(chǎn)物與E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，42℃熱擊、冰浴，涂氨芐抗性固體平板進(jìn)行篩選，37℃倒置培養(yǎng)過夜。挑單克隆送上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序成功后，搖菌，使用無內(nèi)毒素提取試劑盒提取質(zhì)粒。

表2 RAW264.7細(xì)胞中P65shRNA干擾序列Tab.2 P65shRNA interference sequence in RAW264.7 cells

1.2.4 P65干擾片段慢病毒載體包裝

按照5×106個(gè)細(xì)胞 /板的密度將 HEK-293FT傳代至0.1%明膠包被過夜的六孔細(xì)胞培養(yǎng)板；置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；待HEK-293FT細(xì)胞貼壁后，轉(zhuǎn)染HEK-293FT轉(zhuǎn)染慢病毒質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒，本實(shí)驗(yàn)采用四質(zhì)粒系統(tǒng)：一個(gè)主質(zhì)粒12 μg pLL3.7-NC-shRNA/pLL3.7-P65-shRNA-18，3個(gè)輔助質(zhì)粒6 μg VSVG、pMDL、REV。于轉(zhuǎn)染后 6小時(shí)換成完全培養(yǎng)液，此時(shí)記為開始轉(zhuǎn)染0 h。轉(zhuǎn)染后48 h收樣，觀察HEK-293FT細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。

1.2.5 布魯氏菌侵染RAW264.7細(xì)胞

使用電熱恒溫培養(yǎng)箱，37℃，5%CO2，完全濕度，含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)RAW 264.7細(xì)胞，細(xì)胞長(zhǎng)至80%進(jìn)行傳代。布魯氏菌侵染前24 h，六孔板內(nèi)進(jìn)行鋪板，布魯氏菌侵染時(shí)細(xì)胞長(zhǎng)至 70%～90%，MOI按照 1∶100進(jìn)行侵染 60 min，PBS清洗，50單位慶大霉素每孔殺死胞外菌，PBS清洗，更換新鮮培養(yǎng)液，記為侵染0 h。

siRNA和shRNA轉(zhuǎn)染使用Lipofectamine2000 Reagent(Thermo公司，USA)，參照試劑說明書，于37℃，5%CO2，飽和濕度培養(yǎng)6 h后，更換成為含10%血清培養(yǎng)液。進(jìn)行布魯氏菌侵染實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)分組：（1）空白對(duì)照組(infected組)，布魯氏菌侵染侵染正常細(xì)胞作用24 h；（2）陰性對(duì)照組(mock組)，布魯氏菌侵染0 h后，每孔加入7 μL的Lipo 2000，作用 24 h；（3）siRNA 侵染實(shí)驗(yàn)組(P65-siRNA組)，siRNA轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞后，布魯氏菌侵染24 h。（4）shRNA 侵染實(shí)驗(yàn)組(P65-shRNA 組)，shRNA 轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞后，布魯氏菌侵染24 h。

1.2.6 檢測(cè)NF-κB P65蛋白 mRNA表達(dá)

收集轉(zhuǎn)染36 h后的細(xì)胞，按照總RNA提取試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA，并用核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定RNA的濃度及純度。然后按照康為世紀(jì)反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20℃保存。qRT-PCR反應(yīng)條件：95℃ 5 min變性，95 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，50 個(gè)循環(huán)。使用Light Cycler 480熒光定量PCR儀分析軟件自動(dòng)生成Ct值，溶解曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線（表3）。

表3 小鼠 P65 RT-PCR引物序列Tab.3 the RT-PCR primer sequences for the P65 in mouse

2 結(jié)果與分析

2.1 布魯氏菌侵染RAW264.7細(xì)胞相對(duì)于正常細(xì)胞組在24小時(shí)后的相對(duì)表達(dá)量

將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的RAW264.7使用2308布魯氏菌進(jìn)行侵染，使用熒光定量PCR檢測(cè)P65的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示布魯氏菌2308侵染RAW264.7細(xì)胞P65的表達(dá)量明顯升高（圖2）。

圖2 布魯氏菌侵染RAW264.7細(xì)胞P65的相對(duì)表達(dá)量Fig.2 The relative expression of Brucella infecting P65 in RAW264.7 cells

2.2 熒光顯微鏡觀察siRNA-FAM轉(zhuǎn)染RAW264.7的效率觀察

運(yùn)用Lipofectamine 2000 Reagent (Thermo公司，USA)將siRNA-FAM轉(zhuǎn)染常狀態(tài)的RAW264.7細(xì)胞，24 h后用LSM510激光共聚焦顯微鏡觀察巨噬細(xì)胞中的綠色熒光表達(dá)蛋白，結(jié)果顯示siRNA的轉(zhuǎn)染效率可達(dá)70%～80%，證明siRNA-FAM已經(jīng)轉(zhuǎn)染進(jìn)入了RAW264.7細(xì)胞，可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)（圖3）。

圖3 siRNA在小鼠巨噬細(xì)胞 RAW264.7轉(zhuǎn)染效率Fig.3 Effect of siRNA on mouse macrophage RAW264.7 transfection efficiency

2.5 siRNA的篩選

不同分組的siRNA轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞，分組：infected組為布魯氏菌侵染正常的RAW264.7細(xì)胞，NC陰性對(duì)照組，3個(gè)siRNA組結(jié)果表明P65-Mus-1822干擾效果最好，選擇P65-Mus-1822設(shè)計(jì)shRNA進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)（圖4）。

圖4 布魯氏菌侵染RAW264.7細(xì)胞P65 RNA干擾片段篩選Fig.4 Screen siRNA of Brucella infecting P65 in RAW264.7 cells

2.4 pLL3.7酶切效果圖觀察

將pLL3.7空載體菌液過夜搖菌，使用康為世紀(jì)的質(zhì)粒試劑盒提取質(zhì)粒，進(jìn)行HpaⅠ、XhoⅠ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切鑒定，在DNA Marker7000～1000 bp可見一條7635 bp的目的條帶(圖5)。

圖5 pLL 3.7經(jīng)過HpaⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定Fig.5 pLL 3.7 through Hpa I，Xho I double enzyme digestion identification

2.5 shRNA連接PLL 3.7載體測(cè)序結(jié)果

雙鏈P65-shRNA與線性化pLL3.7載體進(jìn)行16℃過夜連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化，42℃熱擊、冰浴，氨芐抗性固體平板篩選，37℃倒置培養(yǎng)過夜。挑單克隆送上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序結(jié)果，結(jié)果顯示PLL 3.7載體與P65-shRNA連接成功，可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.6 PLL3.7-P65-shRNA載體轉(zhuǎn)染293-FT細(xì)胞結(jié)果

由于pLL3.7載體具有GFP基因，將PLL3.7-P65-shRNA載體轉(zhuǎn)染293-FT細(xì)胞，通過激光共聚焦顯微鏡觀察顯示載體轉(zhuǎn)染進(jìn)入了293-FT細(xì)胞，驗(yàn)證PLL 3.7-P65shRNA可以正常表達(dá)（圖6）。

圖6 PLL3.7載體轉(zhuǎn)染293-FT細(xì)胞Fig.6 PLL3.7 vector transfect on 293-FT cells

2.7 不同分組對(duì)RAW264.7細(xì)胞中NF-κB P65相對(duì)表達(dá)情況

所有組均為布魯氏菌24h后收樣，Trizol裂解細(xì)胞，進(jìn)行進(jìn)行熒光定量檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果 如圖1-4與陰性對(duì)照mock組相比，P65-shRNA組表達(dá)略有降低；P65-siRNA組 P65表達(dá)低于P65-shRNA組均低于mock組；布魯氏菌侵染組，P65表達(dá)顯著高于陰性對(duì)照組，表明布魯氏菌侵染組促進(jìn)了NF-κB P65的表達(dá)，P65-shRNA、P65-siRNA組均抑制了NF-κB P65 的表達(dá)（圖 7）。

圖7 siRNA和shRNA干擾布魯氏菌侵染RAW264.7 NF-κB P65相對(duì)表達(dá)量Fig.7 siRNA and shRNA interferes with the relative expression of Brucella infecting RAW264.7 NF-kappa B P65

3 討論

布魯氏菌感染宿主細(xì)胞的初期階段并不會(huì)引起特別強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)[11]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)布魯氏菌的研究使用了小鼠巨噬細(xì)胞系 RAW264.7，該細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，容易培養(yǎng)，布魯氏菌可以被RAW264.7攝取并在其中繁殖，布魯氏菌感染的小鼠模型中，在感染的早期階段炎癥通路并未被觸發(fā)。巨噬細(xì)胞吞噬了布魯氏菌后沒有被活化，雖然布魯氏菌不引起巨噬細(xì)胞強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，但它的感染會(huì)引起宿主體內(nèi)廣泛的病理變化，布魯氏菌會(huì)隨著巨噬細(xì)胞在循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)循環(huán)而留在肝、脾、骨髓、淋巴結(jié)等處，進(jìn)而引起這些器官的炎癥反應(yīng)[12-14]，這與本研究的結(jié)果一致，布魯氏菌侵染宿主細(xì)胞后開始并不會(huì)誘發(fā)強(qiáng)烈炎癥的產(chǎn)生。

宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子NF-κB在炎癥性疾病如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病和自身免疫性疾病以及包括癌癥和動(dòng)脈粥樣硬化等重要炎癥成分的疾病中起著主要作用[15-17]。細(xì)胞炎癥、增殖和凋亡，NF-κB可以被布魯氏菌刺激的RAW264.7激活，被激活的NF-κB與NF-κB抑制蛋白 (iκB)解離轉(zhuǎn)入核內(nèi)與靶基因κB結(jié)合與相應(yīng)基因結(jié)合[18-19]。增強(qiáng)了NF-κB的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)NF-κB P65蛋白在正常狀態(tài)下表達(dá)量很少，在被布魯氏菌侵染RAW264.7引發(fā)炎癥反應(yīng)后，基因表達(dá)顯著上調(diào)，布魯氏菌感染誘發(fā)炎癥與NF-κB的調(diào)控有關(guān)，但具體調(diào)控的哪些信號(hào)通路還需要進(jìn)一步研究。NF-κB p65在抗炎/致炎失衡病理過程中具有重要調(diào)控地位，通過RNAi和shRNA技術(shù)干擾NF-kB p65基因可能改善炎癥細(xì)胞因子過度表達(dá)，為布魯氏菌的治療提供新的思路，為我們進(jìn)一步在基因水平上實(shí)現(xiàn)對(duì)炎癥的控制打下基礎(chǔ)。

RNA 干擾(RNA interference，，RNAi)是生物進(jìn)化過程中一種通過RNA調(diào)控基因表達(dá)的機(jī)制[20]。siRNA是由Dicer酶剪切雙鏈RNA(dsRNA)產(chǎn)生的，并可與酶復(fù)合物結(jié)合成RISC，雙鏈siRNA解鏈成單鏈通過反義鏈與目標(biāo)mRNA結(jié)合，促進(jìn)mRNA酶性降解[21-22]。因其可以特異性干擾基因的表達(dá)，且具有經(jīng)濟(jì)、快捷、高效穩(wěn)定等多種優(yōu)勢(shì)，被廣泛應(yīng)用于基因功能、腫瘤和傳染性疾病等的研究。siRNA特異性抑制同源基因的表達(dá)，但是細(xì)胞內(nèi)的siRNA容易降解，不能對(duì)細(xì)胞因子持續(xù)干擾，與siRNA相比，通過pLL3.7構(gòu)建的質(zhì)粒載體內(nèi)在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)生成shRNA。shRNA最大的優(yōu)勢(shì)在于利用載體上的干擾片段可以建立相對(duì)穩(wěn)定表達(dá)長(zhǎng)期基因沉默細(xì)胞株，在基因沉默的動(dòng)物模型構(gòu)建中更具優(yōu)勢(shì)，對(duì)于一些半衰期較長(zhǎng)的蛋白質(zhì)想要長(zhǎng)期觀察目的蛋白表達(dá)下降對(duì)細(xì)胞表型的影響，就需要長(zhǎng)期基因沉默的效果，shRNA更合適?？傊?，siRNA與shRNA各具優(yōu)缺點(diǎn)，如果用于前期篩選我們就用siRNA，如果用于后期的功能研究就用shRNA，siRNA和shRNA對(duì)細(xì)胞炎癥因子NF-κB作用的統(tǒng)一性和互補(bǔ)性。