王繼雪，孫延鳴*

（石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003）

肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白A（SP-A）是一種親水性糖蛋白的膠原凝集素家族，它的主要功能與宿主的防御相關(guān)，在哺乳動(dòng)物的肺部防御中發(fā)揮重要作用[1]。

Piboonpocanun等[2]通過體外研究人和重組大鼠SP-A蛋白，發(fā)現(xiàn)SP-A能顯著抑制肺炎支原體的生長(zhǎng)。Ledford等[3]把SP-A缺失小鼠作為模型研究其抗肺炎支原體的作用，發(fā)現(xiàn)在SP-A缺失小鼠的氣管中檢測(cè)到的肺炎支原體數(shù)量極顯著高于野生型對(duì)照小鼠，表明在宿主防御肺炎支原體感染中，SP-A起到了關(guān)鍵的作用。Nguyen Huy A[4]發(fā)現(xiàn)SP-A介導(dǎo)抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，對(duì)巨噬細(xì)胞激活狀態(tài)有促進(jìn)作用。Zhang Feng[5]用ELISA方法檢測(cè)SP-A蛋白與呼吸綜合征病毒（PRRSV）的結(jié)合活性，得出重組豬SP-A蛋白在體外可顯著抑制PRRSV的感染。

野生盤羊作為國(guó)家二級(jí)保護(hù)動(dòng)物，是體形最大的羊?qū)賱?dòng)物，其抗病及抗寒旱能力強(qiáng)[6]。巴什拜羊?yàn)榈胤絻?yōu)良綿羊品種，它不僅具有適應(yīng)性強(qiáng)、耐寒、抗病力強(qiáng)等特點(diǎn)，而且羊羔生長(zhǎng)發(fā)育快、毛質(zhì)好、產(chǎn)肉率高、遺傳性穩(wěn)定[7]。海拉提·庫(kù)爾曼等[8]對(duì)野生盤羊與巴什拜羊雜種后代的適應(yīng)性進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)雜交羊繼承了盤羊體格大以及巴什拜羊羔羊階段生長(zhǎng)發(fā)育速度快的遺傳特性，但其易患綿羊支原體肺炎，成活率較低。李志遠(yuǎn)[9]等從發(fā)病的盤羊雜交羊肺組織中分離得到了綿羊肺炎支原體病原。推測(cè)盤羊雜交羊易患綿羊肺炎支原體可能與雜交代羊的呼吸道天然防御能力降低也有關(guān)，而呼吸道天然防御能力降低可能與某些天然防御分子基因的變異有關(guān)。

SP-A作為肺部重要的天然免疫防御分子，在肺的局部防御和天然免疫反應(yīng)中起著十分重要的作用[10]。

目前有關(guān)SP-A的研究主要集中在人類、大、小鼠以及豬上，并且大多尚未涉及具體感染性疾病，其中羊SP-A的研究更少，目前尚未見有羊的有關(guān)該基因功能的研究報(bào)道。為了探討盤羊雜交羊易患綿羊支原體肺炎的特性與該基因之間是否具有關(guān)聯(lián)，本研究通過克隆SP-A基因并對(duì)該基因進(jìn)行真核表達(dá)，為今后研究SP-A蛋白功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物、載體和菌株

試驗(yàn)用5只盤羊雜交羊購(gòu)買于塔城地區(qū)巴什拜羊繁殖基地。表達(dá)載體pPIC9K和巴斯德畢赤酵母GS115由石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院保存。大腸桿菌感受態(tài)DH5α購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要試劑

反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司，限制性內(nèi)切酶NotⅠ、SnaBⅠ、SacⅠ購(gòu)自 TaKaRa公司，T4DNA 連接酶購(gòu)自NEB（北京）有限公司，質(zhì)粒小量制備試劑盒、薄型瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和酵母基因組提取試劑盒均購(gòu)自上海捷瑞生物工程有限公司，D-山梨醇、酵母氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基（YNB）、G418以及生物素購(gòu)自北京博奧拓達(dá)科技有限公司，培養(yǎng)基所用的酵母提取物和胰蛋白胨均購(gòu)自上海坤肯生物化工有限公司，Anti-His Mouse mAb、Goat Anti-Mouse IgG、HRP、Blue PlusⅡProtein Marker購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 SP-A基因片段的擴(kuò)增

在此之前，作者使用RACE方法成功克隆了盤羊雜交羊SP-A基因的cDNA全長(zhǎng)序列，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)該序列設(shè)計(jì)ORF的上游引物SP-A1：5’-TACGTAATGCACCACCACCACCACCACCTGCTGTGCTCTTTGAC-3’，下游引物 SP-A2：5’-GCGGCCGCTCAGAACTCACAGATGG-3’，引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。無菌采集將盤羊雜交羊肺組織并剪成小塊放入無菌、無酶液氮凍存管，放入液氮罐速凍，用液氮研磨的方法將肺組織研成粉末，用Trizol法提取羊肺組織總RNA，用2%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)RNA質(zhì)量，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒按照試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。最后以cDNA為模板進(jìn)行PCR，PCR反應(yīng)體系為：2×Taq PCR MasterMix 10 μL，SP-A1 0.5 μL，SP-A2 0.5 μL，cDNA 1.5 μL，ddH2O 7.5 μL。反應(yīng)條件為：94℃ 5 min，94℃ 45 s，64℃ 35 s，72 ℃ 55 s，25個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min，4 ℃ 保存。1%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)PCR產(chǎn)物并用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目的片段。將膠回收產(chǎn)物與pMD18-T相連接并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)DH5α中，用含氨芐青霉素的LB平板培養(yǎng)基進(jìn)行抗性篩選，后用PCR方法篩選陽性克隆，挑選5個(gè)陽性克隆送北京六合華大基因科技股份有限公司測(cè)序。

1.2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-SP-A的構(gòu)建

分別提取 pMD-18T-SP-A和 pPIC9K質(zhì)粒，用NotⅠ和SnaBⅠ分別對(duì)兩種質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，將酶切后的SP-A基因和pPIC9K載體按1∶3的摩爾比用T4 DNA連接酶在16℃環(huán)境中過夜連接，把連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)DH5α中，用含氨芐青霉素的LB平板培養(yǎng)基進(jìn)行抗性篩選，后用PCR方法檢測(cè)目的基因篩選陽性菌，選取5個(gè)陽性菌提取質(zhì)粒并對(duì)提取的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，將PCR和雙酶切鑒定均正確的菌提取質(zhì)粒并將質(zhì)粒送往北京六合華大基因科技股份有限公司測(cè)序。重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果正確則命名該質(zhì)粒為pPIC9K-SP-A。

1.2.3 重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-SP-A轉(zhuǎn)化與鑒定

制備畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞，參照Riffault[11]方法進(jìn)行操作。將20 μL線性化的重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-SP-A和150 μL畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞混勻，將電轉(zhuǎn)裝置設(shè)置電壓1.5 kv，放電時(shí)間5 ms，電擊轉(zhuǎn)化結(jié)束后立即加入1 mL事先配好的1 mol/L的山梨醇，28℃環(huán)境中靜置1 h，離心后涂布于MD平板培養(yǎng)基，28℃環(huán)境中培養(yǎng)，直到出現(xiàn)單菌落（一般3 d左右）。

將出現(xiàn)的單菌落轉(zhuǎn)移到G418抗性培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，篩選濃度由低濃度向高濃度進(jìn)行，直到篩選出可抗3.0 mg/mL G418的重組酵母菌。用酵母基因組提取試劑盒提取酵母基因組，進(jìn)行基因型和表現(xiàn)型鑒定?；蛐丸b定PCR反應(yīng)體系為：2×Taq PCR MasterMix 10 μL，SP-A1 0.5 μL，SP-A2 0.5 μL，酵母基因組 1.5 μL，ddH2O 7.5 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min，94 ℃ 45 s，64 ℃ 35 s，72 ℃ 55 s，25個(gè)循環(huán)，72℃ 10 min，4℃ 保存。在基因型鑒定中如果能擴(kuò)增出目的條帶則進(jìn)行表現(xiàn)型鑒定，表現(xiàn)型鑒定所用引物序列為 5’AOX1：5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’；3’AOX1：5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’。

表現(xiàn)型鑒定 PCR反應(yīng)體系為：2×Taq PCR MasterMix10 μL，5’AOX1 0.5 μL，3’AOX1 0.5 μL，酵母基因組1.5 μL，ddH2O 7.5 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min，94 ℃ 60 s，54 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，30個(gè)循環(huán)，72℃ 10 min，4℃保存。表現(xiàn)型鑒定中若能擴(kuò)增出2條帶，其中一條帶為AOX1基因（大約2.2 kb），另一條帶與目的基因相關(guān)（大約為1.3kb），則說明該轉(zhuǎn)化子為陽性轉(zhuǎn)化子Mut+。

1.2.4 重組畢赤酵母誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE分析

將M ut+重組畢赤酵母單菌落接種于50 mLBMGY培養(yǎng)基中，28℃，250rpm震蕩培養(yǎng)至OD值為4，8000 r/min離心3 min收集菌體，將收集的菌體轉(zhuǎn)移到200 mLBMMY培養(yǎng)基中進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，每隔24 h補(bǔ)加甲醇1次，使甲醇終濃度為 0.5%，同時(shí)按照 0、24、48、72、96 h 收集 1 mL菌液樣品，將菌液8000 r/min，離心 6 min后，收集900 μL上清，TCA沉淀法將蛋白濃縮后進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.5 western blot鑒定

目的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，將蛋白電轉(zhuǎn)到PVDF膜上，將膜用TBST清洗 3次（10 min/次）后浸入封閉液中室溫封閉1h；一抗用Anti-His Mouse mAb(1∶1000)4℃孵育過夜，過夜后室溫放置1 h后用 TBST清洗 3次（10min/次），二抗用 Goat Anti-Mouse IgG，HRP（1∶3000）室溫孵育 90 min，然后用TBST清洗3次（10 min/次），最后用DAB顯色液進(jìn)行顯色并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 肺組織總RNA的提取

從盤羊雜交羊肺組織中提取的總RNA用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，可看到3條帶：28S、18S和5S（圖1）。可以看到28S條帶亮度大約是18S條帶亮度的2倍，用紫外檢測(cè)儀測(cè)定RNA OD260/OD280的值是1.91，說明所提取的肺組織總RNA完整性和純度很好，可用于后續(xù)RT-PCR。

圖1 肺組織總RNA電泳圖Fig.1 The RNA electrophoresis of lung

2.2 目的基因SP-A的擴(kuò)增

以肺組織總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，SP-A1和 SP-A2分別為上下游引物，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，可見與預(yù)期片段大小相符合的782 bp的條帶，SP-A基因的ORF序列大小為747 bp，添加的6×His tag標(biāo)簽序列大小為18 bp，啟動(dòng)子序列大小為 3 bp，NotⅠ識(shí)別序列為 8 bp，SnaBⅠ識(shí)別序列為6 bp，經(jīng)測(cè)序后與預(yù)期結(jié)果一致，將該基因序列在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)該基因同綿羊SP-A基因序列同源性最高，可達(dá)99.7%（圖 2）。

圖2 SP-A基因電泳圖Fig.2 Electrophoresis of SP-A gene

2.3 重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-SP-A雙酶切鑒定

用NotⅠ和SnaBⅠ兩種酶對(duì)重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-SP-A進(jìn)行雙酶切可得到777 bp的目的條帶（SP-A 基因的ORF序列大小為747 bp，添加的6×His tag標(biāo)簽序列大小為18 bp，啟動(dòng)子序列大小為3 bp，NotⅠ酶切后的序列大小為6 bp，SnaBⅠ酶切后的序列大小為3 bp），經(jīng)0.7%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)后可見與預(yù)期片段大小相符的片段（圖3），且該片段經(jīng)測(cè)序后證明是目的基因片段，表明目的片段已成功插入到pPIC9K真核表達(dá)載體中。

圖3 重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-SP-A雙酶切鑒定Fig.3 The enzyme digestion analysis of recombinant plasmid pPIC9K-SP-A

2.4 重組畢赤酵母GS 115基因型和表現(xiàn)型鑒定

以重組畢赤酵母GS115的基因組作為模板，進(jìn)行基因型鑒定，PCR產(chǎn)物可見一條782 bp的條帶（圖4）。進(jìn)行表現(xiàn)型鑒定，PCR產(chǎn)物可見2條帶，一條帶為AOX1基因（大約2.2 kb），另一條帶與目的基因相關(guān)（大約為1.3 kb）（圖4），與Mut+表現(xiàn)型PCR產(chǎn)物的特征相符，表明重組畢赤酵母GS115 pPIC9K-SP-A整合成功。

圖4 重組畢赤酵母GS115 pPIC9K-SP-A的基因型和表現(xiàn)型鑒定Fig.4 The genotype and phenotype identification of recombinant pichia pastoris GS115 pPIC9K-SP-A

2.5 重組畢赤酵母GS115表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

重組畢赤酵母GS115 pPIC9K-SP-A經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)后，收集 0、24、48、72、96 h 表達(dá)上清，TCA 沉淀法將上清蛋白濃縮后，用SDS-PAGE技術(shù)分析濃縮后的蛋白，在27.33 kD處出現(xiàn)了與預(yù)期目的蛋白分子量相符的條帶，而GS115 pPIC9K空載質(zhì)粒和GS115 pPIC9K-SP-A在0 h時(shí)，在27.33 kD處未發(fā)現(xiàn)條帶（圖5），此外，隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白表達(dá)量逐漸增大，96 h時(shí)表達(dá)量最高，表明目的蛋白成功表達(dá)。

圖5 重組畢赤酵母GS115 pPIC9K-SP-A表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE分析Fig.5 The SDS-PAGE analysis of expression products from recombinant pichia pastoris GS115 pPIC9K-SP-A

2.6 western blot鑒定

將96 h蛋白表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，將蛋白電轉(zhuǎn)到NC膜上，經(jīng)western blot分析后可見一條27.33kD左右的條帶（圖6），與目的蛋白分子量大小一致，表明所表達(dá)的蛋白就是目的蛋白。

圖6 盤羊雜交羊SP-A蛋白的Western blotting結(jié)果Fig.6 The western blotting of Protein SP-A of argali hybrid sheep

3 討論

本次試驗(yàn)所用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是目前所應(yīng)用的僅次于大腸桿菌的表達(dá)系統(tǒng)，在蛋白表達(dá)上更是被實(shí)驗(yàn)室廣泛應(yīng)用[12]。畢赤酵母培養(yǎng)成本低，生長(zhǎng)周期短且可進(jìn)行高密度培養(yǎng)，胞內(nèi)的強(qiáng)效誘導(dǎo)啟動(dòng)子PAOX可對(duì)插入基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，外源基因與畢赤酵母染色體同源重組后，重組子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定有利于外源蛋白的表達(dá)[13]。由于其胞內(nèi)含有合成過氧化酶的結(jié)構(gòu)，這使得外源基因在表達(dá)目的蛋白過程中防止目的蛋白的消耗，使得目的蛋白產(chǎn)量升高[14]。此外，巴斯德畢赤酵母以pPIC9K為真核表達(dá)載體，目的蛋白可分泌到細(xì)胞外，而畢赤酵母自身表達(dá)蛋白量只占極少的部分[15]。試驗(yàn)選用巴斯德畢赤酵母GS115作為表達(dá)菌株，結(jié)合真核表達(dá)載體pPIC9K將有利于目的蛋白的獲取，另外這也為后期蛋白純化提供了方便。

一些研究表明，高濃度甲醇的誘導(dǎo)可以提高細(xì)胞的生長(zhǎng)速率和蛋白的表達(dá)量[16]。然而，在高濃度的甲醇對(duì)生產(chǎn)力的負(fù)面影響的一些報(bào)道，主要是由于其毒性[17]。在目前的研究中，Wu等[18]用一系列的甲醇濃度（0.1-5%）對(duì)畢赤酵母誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基進(jìn)行了測(cè)試，發(fā)現(xiàn)當(dāng)培養(yǎng)基中甲醇濃度為1%時(shí)，蛋白表達(dá)產(chǎn)量最高。但是高濃度的甲醇處理會(huì)導(dǎo)致某些蛋白質(zhì)二硫鍵不能正確形成，從而影響蛋白的表達(dá)。為確保蛋白二硫鍵的正確形成，也為了減少培養(yǎng)基中毒性代謝產(chǎn)物的生成，本次試驗(yàn)用0.5%甲醇濃度對(duì)重組酵母菌進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá)，而未選擇蛋白表達(dá)產(chǎn)量最高的甲醇誘導(dǎo)濃度。

基因拷貝數(shù)已被確定為畢赤酵母表達(dá)外源蛋白的一個(gè)重要的參數(shù)，在許多情況下，多拷貝轉(zhuǎn)化子具有更高的表達(dá)水平[19]，但是也有相關(guān)研究表明目標(biāo)基因拷貝數(shù)增加對(duì)蛋白表達(dá)水平具有負(fù)面影響[20]。本次試驗(yàn)對(duì)不同拷貝數(shù)的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，通過一系列的表達(dá)篩選確定最佳拷貝數(shù)的轉(zhuǎn)化子，而不是直接選用最大的拷貝數(shù)的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá)，這樣確保了目的蛋白穩(wěn)定高效的表達(dá)。

杜智慧等[21]對(duì)盤羊雜交羊和巴什拜羊分別人工感染MO，通過觀察所感染的羊的臨床癥狀及剖解后的肺組織學(xué)病理變化，檢測(cè)羊血清中的IFN-γ、IL-1β、IL-6及IL-9濃度，經(jīng)綜合比較分析發(fā)現(xiàn)盤羊雜交羊?qū)O更易感。SP-A是肺部天然免疫防御分子，在動(dòng)物肺的局部防御和天然免疫中起到很重要的作用，此前的RACE結(jié)果發(fā)現(xiàn)盤羊雜交羊SP-A開放ORF序列與巴什拜羊相比有2處堿基差異，可以推測(cè)，盤羊雜交羊?qū)O易感可能與SP-A基因有關(guān)。本次實(shí)驗(yàn)成功真核表達(dá)了盤羊雜交羊的SP-A蛋白，為我們進(jìn)一步研究盤羊雜交羊易感MO的特性奠定了基礎(chǔ)。

本次實(shí)驗(yàn)通過RT-PCR的方法克隆了盤羊雜交羊SP-A基因的編碼序列，然后將該序列與真核表達(dá)載體pPIC9K相連接并電轉(zhuǎn)入巴斯德畢赤酵母GS115中，用甲醇誘導(dǎo)成功表達(dá)了SP-A蛋白，經(jīng)Western blotting鑒定表明所表達(dá)蛋白為目的蛋白，為進(jìn)一步研究盤羊雜交羊SP-A蛋白的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。