信小兵 ，李林 ，田星 ，張珂 ，劉丹妮 ，王航宇 ，王金輝 ，2*

（1石河子大學(xué)藥學(xué)院/新疆植物藥資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832002；2哈爾濱醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150081）

帕金森?。≒arkinson's Disease，PD）是一種嚴(yán)重困擾人們健康的神經(jīng)退行性疾病，多發(fā)于中老年人群。目前，在我國60歲以上人群中PD患病率大于1%。研究表明，PD是一種由于黑質(zhì)－紋狀體多巴胺能神經(jīng)元變性、壞死，而導(dǎo)致以震顫、肌僵直和運(yùn)動遲緩等臨床癥狀為特征的神經(jīng)變性疾病[1]。目前，對帕金森病的治療還沒有特效藥，已經(jīng)上市的藥物都因?yàn)榀熜Р患鸦蚨靖弊饔么筝^難滿足要求。因此，尋找具有神經(jīng)保護(hù)作用的天然藥物活性成分對于PD的治療很有意義。

1，5-O-二咖啡酰-3-O-（4-蘋果酸甲酯）-奎寧酸 （1，5-O-dicaffeoyl-3-O-（4-malic acid methyl ester）-quinic acid，MQA）是從牛蒡根中提取分離得到的一種二咖啡?；鼘幩犷惢衔颷2]。目前報道這類化合物具有許多的生物活性，如抗氧化、抗菌、抗腫瘤和抑制α糖苷酶的作用[3-4]。研究表明[5]二咖啡酰基奎寧酸類化合物可抑制Aβ42誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷。在此基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)將在1-甲基-4-苯基-吡啶離子（1-methyl-4-phenylpyridinium，MPP+）誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷模型上，建立體外PD模型，考察MQA抗MPP+誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷作用及其作用機(jī)制，為進(jìn)一步開發(fā)全新治療帕金森病的藥物打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品及主要試劑

MQA單體（由本實(shí)驗(yàn)室自制，純度 98%）；小牛血清（杭州四季青生物制品公司，批號：150520）；DMEM 培養(yǎng)基（GIBCO公司，批號：129007）；山羊抗小鼠抗體（批號：127655）、山羊抗兔抗體（批號：129256）、β-actin抗體（批號：16A00205）均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；AMPKβ1/2抗體（批號：57C12）、LC3A/B 抗體（批號：D3U4C）、Beclin-1抗體（批號：D40C5）均購自Cell Signaling Technoligy公司；蛋白裂解液（Radio Immunoprecipitation Assay，RIPA，批號：20160420）、苯甲基磺酰氟（Phenyl methane sulfonyl fluoride，PMSF，批號：20160328）、蛋白濃度測定試劑盒（bicinchoninic acid，BCA，批號：20151225）、噻唑藍(lán)（MTT，批號：705B0514）、二甲基亞砜（DMSO，批號：302A0319）均購自北京索萊寶科技有限公司。

1.1.2 主要儀器

CO2培養(yǎng)箱（Thermo Scientific公司）；離心機(jī)（上海安亭TDL-40B）；DYCZ-24DN制膠器（北京六一生物科技有限公司）；DYCZ-40D型電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；power wave XS2酶標(biāo)儀（美國BIO-RAD公司）；TDZ5-WS多管架自動平衡離心機(jī)（湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（美國Costar公司）；CAP8201分析天平（德國Sartorius公司）。

1.2 方法

1.2.1 建立MPP+所致的SH-SY5Y細(xì)胞損傷模型

取對數(shù)生長期的SH-SY5Y細(xì)胞，以1.0×105/mL密度接種于96孔板內(nèi)，100 μL/well，細(xì)胞貼壁培養(yǎng)24h后加入終濃度為 0.01、0.2、1、2.5、5 和 10 mol/L的MPP+，再置于5%CO2，37℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h。然后向細(xì)胞液中加入MTT溶液（終濃度為0.5 mg/mL），于37℃下共同孵育4 h。棄去上清液，加入DMSO溶液，150 μL/well，振蕩溶解后使用酶標(biāo)儀于490 nm處測定其吸光度（OD）值，并按照下列公式計算細(xì)胞存活率（cell viability）%，每組設(shè)3個復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

細(xì)胞存活率%=（樣品組OD值的平均值/對照組OD值的平均值）×100%。

1.2.2 MQA抗MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷模型

取對數(shù)生長期的SH-SY5Y細(xì)胞，以1.0×105/mL密度接種于96孔板內(nèi)，100 μL/well，細(xì)胞貼壁培養(yǎng)24h后加入終濃度為 10、20、40、80 μmol/L 的MQA。處理2 h后，加入濃度為2.5 mmol/L的MPP+，置于5%CO2，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h。然后向細(xì)胞液中加入MTT溶液（終濃度為0.5 mg/mL），于37℃下共同孵育4 h。棄去上清液，加入DMSO溶液，150 μL/well，振蕩溶解后使用酶標(biāo)儀于 490 nm處測定其吸光度（OD）值，并按照下列公式計算細(xì)胞存活率（cell viability）%，每組設(shè)3個復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

細(xì)胞存活率%=（樣品組OD值的平均值/對照組OD值的平均值）×100%。

1.2.3 Western Blot實(shí)驗(yàn)Western blot檢測AMPKβ1/2、LC3A/B、Beclin-1蛋白的表達(dá)

細(xì)胞分為正常組、模型組（2.5 mmol/L MPP+24 h）、MQA 低劑量組（MQA 20 μmol/L 2 h+2.5 mmol/L MPP+24 h）、MQA 中劑量組（MQA 40 μmol/L 2 h+2.5 mmol/L MPP+24 h）、MQA 高劑量組（MQA 80 μmol/L 2 h+2.5 mmol/L MPP+24 h）。各組細(xì)胞 以 1.5×105/mL起始濃度接種于培養(yǎng)瓶，待細(xì)胞貼壁，培養(yǎng)48 h后，棄去培養(yǎng)基，收集細(xì)胞懸液于離心管中，1000 r/min離心5 min，棄去上清液，用 1/2體積的PBS懸浮后，再次離心，加入適量細(xì)胞裂解液，4℃裂解30～60 min后使其充分裂解，裂解完全后進(jìn)行離心，以12000 r/min，4℃離心10 min，取上清液，提取總蛋白。用BCA蛋白定量法測定蛋白濃度，進(jìn)行蛋白定量，沸水煮15 min，使蛋白變性，冷卻至室溫以后保存在-20℃冰箱中，備用。進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，根據(jù)蛋白需要適時停止電泳，取出電泳凝膠，按照所對應(yīng)的分子量切割進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，封閉，置于稀釋過的AMPKβ1/2、LC3A/B和Beclin-1一抗溶液中，4℃過夜后，再取出用TBST液漂洗6次后，相應(yīng)加入稀釋后的二抗溶液，搖床上雜交1 h，取出洗膜，加入ECL，上機(jī)檢測。采用ImageJ圖像分析軟件測定條帶的光密度，計算灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行處理，數(shù)值用±S表示，兩組間的比較采用單因素方差分析 （one-way ANOVA） 及 T檢驗(yàn)（Students t-test），P＜0.05 即認(rèn)為具有顯著差異，P＜0.01 為差異有極顯著性，P＞0.05為差異無顯著性。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 MPP+誘導(dǎo) SH-SY5Y細(xì)胞損傷模型結(jié)果

由圖1可知，在MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷模型中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著MPP+濃度升高，細(xì)胞存活率下降，且呈現(xiàn)計量依賴性。由SPSS統(tǒng)計軟件處理得出，MPP+濃度為2.5 mmol/L時細(xì)胞的存活率為56.07%±5.11%，與正常有極顯著性差異（P＜0.01）。MPP+濃度為2.5 mmol/L以上時，雖然與正常組有極顯著性差異（P＜0.01），但是濃度過高，從節(jié)省試劑的角度考慮，本實(shí)驗(yàn)選取2.5mmol/L作為細(xì)胞損傷模型的濃度。

圖1 不同濃度MPP+作用細(xì)胞的存活率Fig.1 Survival rate of MPP+cells with different concentrations

2.2 MQA抗MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷作用

由圖2可知，與單獨(dú)用2.5 mmol/L MPP+誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷模型相比，MQA處理后細(xì)胞存活率明顯上升，隨著MQA的濃度升高，細(xì)胞存活率升高，且呈現(xiàn)計量依賴性，表明MQA具有抗MPP+誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷作用。由SPSS數(shù)據(jù)處理軟件得出，在各給藥各組中，MQA濃度為10 μmol/L時，給藥組與模型組沒有顯著性差異，MQA濃度為 20、40、80 μmol/L時，與模型組比較有極顯著性差異（P＜0.01），表明MQA濃度為20、40、80 μmol/L時，抗細(xì)胞損傷作用較明顯，故后續(xù)Western Blot實(shí)驗(yàn)給藥濃度定為：20 μmol/L（低劑量）、40 μmol/L（中劑量）、80 μmol/L（高劑量）。

圖2 MQA抗MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷作用Fig.2 MQA anti MPP+induced SH-SY5Y cell injury

2.3 Westrrn blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖3可知，與正常組相比，在2.5 mmol/L誘導(dǎo)的模型組中AMPKβ1/2蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.01），與模型組相比各給藥組中AMPKβ1/2蛋白表達(dá)明顯下降（P＜0.01），且隨著 MQA劑量的增加 AMPKβ1/2蛋白表達(dá)依次下降，且呈現(xiàn)一定的計量依賴性；與正常組相比，在2.5 mmol/L誘導(dǎo)的模型組中LC3A/B蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.01），與模型組相比各給藥組中LC3A/B蛋白表達(dá)明顯下降（P＜0.01），且隨著MQA劑量的增加LC3A/B蛋白表達(dá)依次下降，且呈現(xiàn)一定的計量依賴性；與正常組相比，在2.5 mmol/L誘導(dǎo)的模型組中Beclin-1蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.01），與模型組相比各給藥組中Beclin-1蛋白表達(dá)明顯下降（P＜0.01），且隨著MQA劑量的增加Beclin-1蛋白表達(dá)依次下降，且呈現(xiàn)一定的計量依賴性。

圖3 MQA對MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞AMPKβ1/2、LC3A/B、Beclin-1表達(dá)的影響Fig.3 Effects of MQA on the expressions of AMPKβ1/2、LC3A/B、Beclin-1 induced by MPP+in SH-SY5Y cells

3 討論

1-甲基-4-苯基-吡啶離子（1-methyl-4-phenylpyridinium，MPP+）是線粒體復(fù)合物Ⅰ的抑制劑，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MPP+能造成SH-SY5Y細(xì)胞損傷，可作為帕金森病神經(jīng)元細(xì)胞損傷的模型。在MPP+誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷模型中給藥（MQA），實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明各給藥組與模型組相比，細(xì)胞存活率均提高，且隨著劑量的增大逐漸提高。因此二咖啡?；鼘幩酠QA具有抗MPP+誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷作用。

自噬是自噬溶酶體對其包裹的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含物進(jìn)行降解的一種分解代謝過程，自噬能夠清除錯誤折疊的蛋白質(zhì)，減少蛋白質(zhì)在神經(jīng)元內(nèi)聚集，可有效預(yù)防帕金森病等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生。然而，自噬過度活躍會引起自噬應(yīng)激，可能會引起神經(jīng)細(xì)胞的死亡，從而導(dǎo)致帕金森病的發(fā)生。越來越多研究表明[6]細(xì)胞自噬也參與了帕金森病的發(fā)病過程。

腺苷酸激活的蛋白激酶（AMPK）是一種高度保守的蛋白激酶，它在能量平衡中起關(guān)鍵性作用。在熱激，缺氧，缺血，饑餓等環(huán)境因素的刺激下，引起AMP/ATP濃度比的升高，AMP/ATP濃度比的升高可以激活 AMPK。活化的 AMPK催化 ULK1第 317、467、555、637和777位絲氨酸發(fā)生磷酸化，使形成ULK1-Atg13-FIP200復(fù)合物，從而促進(jìn)自噬[7]。

Beclin-1 可與 Barkor、Vps34、Vps15 結(jié)合 ，形成PI3K復(fù)合物III。該復(fù)合物是吞噬泡形成所必需的，因此Beclin-1是調(diào)控自噬的關(guān)鍵因子[8]。LC3參與了自噬體膜的形成，包括兩種可相互轉(zhuǎn)化的形式即LC3-I和LC3-II。細(xì)胞內(nèi)新合成的 LC3經(jīng)過加工，成為胞漿可溶形式的 LC3-I，后者經(jīng)泛素化加工修飾，與自噬體膜表面的 PE結(jié)合，成為膜結(jié)合形式的 LC3-II。LC3-II定位于前自噬體和自噬體，是自噬體的標(biāo)志分子，隨自噬體膜的增多而增加[9]。

在細(xì)胞損傷模型組中，AMPKβ1/2、Beclin-1蛋白和LC3蛋白高表達(dá)或許與SH-SY5Y細(xì)胞的自噬有關(guān)。MQA 可降低 AMPKβ1/2、LC3A/B、Beclin-1蛋白的表達(dá)量。由此推測，MQA抗MPP+誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞損傷作用可能與抑制細(xì)胞自噬有關(guān)。