錢歡，凌君曼，曾瑩瑩，曾欣，李興琳，呼海燕*

（成都醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，四川 成都，610500）

骨質(zhì)疏松癥作為常見的老年性疾病，目前已成為全球主要公共衛(wèi)生問題之一[1]。骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生與骨代謝有著密切聯(lián)系。骨代謝主要是由破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收和成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成[2]，在多種代謝通路調(diào)節(jié)下共同維持骨的正常形態(tài)及功能。生長分化因子 11（growth difference factor11，GDF11）屬于生長轉(zhuǎn)化因子-β超家族成員，能夠調(diào)節(jié)多個系統(tǒng)和器官如腎臟、神經(jīng)系統(tǒng)和骨骼系統(tǒng)等的發(fā)育[3]，也是胚胎中軸骨發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因子[4]，有文獻(xiàn)[5]報道GDF11通過抑制PPAR-γ活性促使其蛋白泛素化(small ubiquitin-related modifier,SUMO)修飾，從而改變骨骼脆性，認(rèn)為補(bǔ)充GDF11可以治療老年性骨質(zhì)疏松癥。維生素D是維持機(jī)體健康的重要營養(yǎng)物質(zhì)，它的活性形式為1,25(OH)2D3，在骨骼發(fā)育上起到至關(guān)重要的作用[6]，主要通過1,25(OH)2D3/VDR信號[7]及OPG/RANKL系統(tǒng)[8]來調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化，但也有學(xué)者提出BMP-2/Smads/Runx2[9-10]也是其調(diào)節(jié)途徑之一。目前研究顯示維生素D聯(lián)合補(bǔ)充鈣也具有預(yù)防骨質(zhì)疏松的作用[11]。

雖然已知GDF11和維生素D都有治療骨質(zhì)疏松癥的作用，但目前并未有GDF11和維生素D共同作用的相關(guān)實驗研究報道。為此，本研究采用體外培養(yǎng)UMR106成骨樣細(xì)胞，探討GDF11和維生素D共同對細(xì)胞增殖以及Runx2、Osterix基因表達(dá)的影響，為骨質(zhì)疏松癥臨床干預(yù)治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與分組

主要試劑：維生素D（總脫鈣化固醇），由四川大學(xué)魏大鵬惠贈；GDF11購自R＆D systems。

實驗分組：Group1：control；Group2:50 ng/mL GDF11;Group3:100 ng/mLGDF11；Group4：維生素 D；Group5：50 ng/mLGDF11+ 維生素 D；Group6：100 ng/mLGDF11+維生素D。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將UMR106細(xì)胞(大鼠骨肉瘤細(xì)胞株，四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院陳雨雪教授惠贈)接種于含10%新生牛血清（四季青公司）、2%雙抗（Billab公司）的DMEM高糖培養(yǎng)液（Gibco公司）中，置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技公司）內(nèi)培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后每2 d換液1次，待細(xì)胞融合至80%～90%時使用0.25%胰蛋白酶（Sigma公司）消化，按1:2傳代。

1.3 MTT法檢測細(xì)胞增殖能力

將處于對數(shù)生長期的UMR106細(xì)胞消化并計數(shù)后，按5×103/孔的濃度接種于96孔板，每孔200 μL，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，每組設(shè)8個復(fù)孔。每孔加入含藥物培養(yǎng)液 200 μL，繼續(xù)培養(yǎng) 24、48、72 h后，按MTT（Sigma公司）試劑說明進(jìn)行操作，使用酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司）在490 nm處測吸光度（OD）值。

1.4 細(xì)胞ALP活性檢測

將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞按2×104/孔的濃度接種于24孔板中，每孔1 mL，每組5個復(fù)孔。加藥分別培養(yǎng)24、48和72 h后，按ALP試劑盒（碧云天科技公司）操作步驟檢測ALP活性：加入0.2%的Triton x-100裂解，離心取上清，取50 μL上清液加入50 μL顯色底物，37℃孵育10 min，加入100 μL反應(yīng)終止液終止反應(yīng)，在405 nm處測OD值。使用標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算堿性磷酸酶活性。

1.5 RT-PCR檢測細(xì)胞Runx2 mRNA和Osterix mRNA的表達(dá)

將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞按5×104/孔的濃度接種于6孔板中，每孔2 mL，每組4個復(fù)孔。加藥分別培養(yǎng)24、48和72 h后，提取總RNA。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒操（Takara公司）作步驟將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用 SYBR green 染料（Takara公司）法，實時熒光定量PCR（qRT-PCR，Bio-Rad公司）檢測各組細(xì)胞 Runx2及 Osterix的 mRNA表達(dá)，β-actin作為內(nèi)參。反應(yīng)體系為20μl，反應(yīng)條件：95℃，3 min反應(yīng)一個循環(huán)，95℃ 15 s，55℃ 15 s，共反應(yīng)40個循環(huán),65℃ 5 s。引物序列如下：Runx2的正向引 物 序 列 為 ：5’-CCGTGTCAGCAAAACTTCTT-3’，反向引物序列為：5’-CTCACGTCGCTCATCTTGC-3’；Osterix的正向引物序列為：5’-GGACAGCCAACCCTAGCC-3’，反向引物序列為：5’-TGGAGCCACCAAACTTGC-3’；β-actin 的 正 向 引 物 序 列 為 ：5’-CCCGCGAGTACAACCTTCT-3’，反向引物序列為：5’-CGTCATCCATGGCGAACT-3’，引物由成都擎科生物公司合成。反應(yīng)結(jié)束后，使用溶解曲線判斷特異性，將各樣本的Ct值與β-actin內(nèi)參基因做對照，基因相對表達(dá)量采用2－△△Ct法計算。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)和數(shù)目

UMR106細(xì)胞是大鼠成骨肉瘤細(xì)胞系細(xì)胞，既具有成骨細(xì)胞的典型形態(tài)，也具有成骨細(xì)胞的生化功能[12]，其活性水平較原代培養(yǎng)的大鼠顱骨成骨細(xì)胞高，細(xì)胞增殖周期約為20 h。

細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，顯微鏡下觀察，見大量細(xì)胞貼壁，呈鋪展生長狀態(tài)，細(xì)胞多呈梭形、紡錘形。加藥培養(yǎng)24 h后，成骨細(xì)胞典型形態(tài)愈發(fā)明顯，且細(xì)胞數(shù)量明顯增多，呈集落生長趨勢（圖1）。

圖1 各組細(xì)胞形態(tài)和相對數(shù)量Fig.1 Cell morphology and relative quantity in each group

2.2 GDF11和維生素D對細(xì)胞增殖的影響

GDF11和維生素D對細(xì)胞增殖的影響見圖2。

圖2 GDF11和維生素D對細(xì)胞增殖的影響Fig.2 The effects of GDF11 and Vitamin D on cell proliferation

如圖2A所示，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，與Control比，各組細(xì)胞增殖更為顯著（P＜0.05）；與 Group2相比，Group5細(xì)胞增殖明顯增多（P＜0.01）；與 Group3相比，Group6細(xì)胞增殖減少明顯（P＜0.01）；Group4細(xì)胞增殖較 Group2、6細(xì)胞增殖更為顯著（P＜0.05）。培養(yǎng)48 h（圖 2B）后，與 Control相比，Group2、3、5 細(xì)胞增殖明顯增多（P＜0.05），Group4、6細(xì)胞增殖無明顯差異；與Group2相比，Group5細(xì)胞增殖亦明顯減少（P＜0.01）；與 Group3相比，Group6細(xì)胞增殖明顯減少（P＜0.01）；與 Group4 相比，Group3、5 細(xì)胞增殖明顯增多（P＜0.01）。培養(yǎng) 72 h（圖 2C）后，與 Control相比，Group2、3、5 及 6 細(xì)胞增殖顯著 （P＜0.05），與Group2相比，Group5細(xì)胞增殖亦明顯減少（P＜0.01），Group4細(xì)胞增殖無明顯差異；與Group3相比，Group6細(xì)胞增殖明顯減少（P＜0.05）；與 Group4相比，其他各實驗組細(xì)胞增殖明顯（P＜0.01）。

2.3 GDF11和維生素D對細(xì)胞ALP活性的影響

GDF11和維生素D對細(xì)胞ALP活性的影響見圖3。

圖3 GDF11和維生素D對細(xì)胞ALP活性的影響Fig.3 The effect of GDF11 and vitamin D on the activity of ALP in cultured cells

如圖3所示，與Control相比，Group4在細(xì)胞培養(yǎng) 24、48和 72h后 ALP活性均無顯著差異。Group2、3、5、6 ALP活性明顯提高（P＜0.05）。 與Group4相比，Group2、3、5、6 僅在 24、48 h ALP 活性提高有顯著差異（P＜0.05）。

2.4 GDF11和維生素 D對細(xì)胞 Runx2、Osterix mRNA表達(dá)的影響

GDF11和維生素D對細(xì)胞Runx2、Osterix mRNA表達(dá)的影響見圖4。

圖4 GDF11和維生素D對培養(yǎng)細(xì)胞Runx2、Osterix mRNA表達(dá)的影響Fig.4 Effects of GDF11 and vitamin D on the expression of Runx2 mRNA and Osterix mRNA in cultured cells

如圖4A所示，培養(yǎng)24 h后，與對照組相比，Group2、3及5細(xì)胞Runx2 mRNA表達(dá)量顯著提高（P＜0.05），Group4、6細(xì)胞 Runx2 mRNA 表達(dá)量無明顯差異。培養(yǎng)48 h后，與對照組相比，Group2、3及6細(xì) 胞 Runx2mRNA 表達(dá)量提高顯著（P＜0.05），Group4、5細(xì)胞Runx2 mRNA表達(dá)量無明顯差異；與Group3相比，Group 6細(xì)胞 Runx2 mRNA表達(dá)量明顯減少（P＜0.01）。培養(yǎng) 72 h后，與對照組比，Group2、3及6細(xì)胞Runx2 mRNA表達(dá)量提高顯著（P＜0.05），Group4、5表達(dá)量無明顯差異。

如圖4B所示，培養(yǎng) 24 h后，與 Control比，Group2、3及6細(xì)胞Osterix mRNA表達(dá)量提高顯著（P＜0.05），Group4、5細(xì)胞 Osterix mRNA 表達(dá)量無明顯差異；與Group2比較，Group5細(xì)胞Osterix mRNA表達(dá)量減少顯著（P＜0.05）。培養(yǎng)48 h后，與Control比，Group2、3及6細(xì)胞Osterix mRNA表達(dá)量提高顯著（P＜0.05），Group4、5 細(xì)胞 Osterix mRNA 表達(dá)量無顯著差異。培養(yǎng)72 h后，與Control比，其他各組細(xì)胞Osterix mRNA表達(dá)量改變均無明顯差異。

3 討論

骨質(zhì)疏松癥目前已位世界常見病、多發(fā)病的第7位，是一種年齡相關(guān)的慢性疾病，其發(fā)生的主要病理機(jī)制是成骨細(xì)胞的增殖與分化受到抑制，最終導(dǎo)致骨量減少和骨質(zhì)疏松。因此提高成骨細(xì)胞的增殖和分化是預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥的關(guān)鍵。成骨細(xì)胞主要來源于多能干細(xì)胞-骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞高表達(dá) Runx2和Osterix時，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。Runx2是一種能夠調(diào)控許多成骨相關(guān)基因（如Osterix等）轉(zhuǎn)錄的成骨分化特異性轉(zhuǎn)錄因子，可促進(jìn)成骨細(xì)胞的成熟和胞外基質(zhì)的分泌[13]。而Osterix是目前發(fā)現(xiàn)的最直接的調(diào)控骨形成的轉(zhuǎn)錄因子，位于Runx2的下游，它的缺失可直接使成骨細(xì)胞完全喪失骨形成能力[14]。

GDF11是近年來研究的熱點抗衰老因子，與骨代謝有著密切聯(lián)系。Sinha等[5]研究表明，骨質(zhì)疏松癥患者血漿和骨髓中的GDF11水平明顯降低，補(bǔ)充可以增強(qiáng)肌肉的結(jié)構(gòu)和功能。然而Weiqing Lin[15]團(tuán)隊則認(rèn)為GDF11抑制成骨細(xì)胞分化，從而減少了骨量。我們前期實驗研究發(fā)現(xiàn)，GDF11（50、100 ng/ml）對UMR106成骨樣細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用（文章已投），說明GDF11和成骨細(xì)胞的增殖有著密切的聯(lián)系。我們的實驗結(jié)果表明，GDF11可通過提高Runx2、Osterix mRNA表達(dá)來促進(jìn)成骨樣細(xì)胞增殖和提高細(xì)胞內(nèi)ALP活性，與前期實驗結(jié)果一致。

維生素D是體內(nèi)重要的維持鈣、磷代謝穩(wěn)定的一種類固醇激素，其活性代謝產(chǎn)物是1α,25(OH)2D3。目前研究表明大鼠服用活性維生素D3可以增加成骨細(xì)胞的數(shù)量，并提示可能與成骨細(xì)胞內(nèi)存在維生素D受體有關(guān)[16]。資料顯示維生素D通過OPG/RANKL信號通路對骨代謝起調(diào)節(jié)作用，維生素D促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖[17]，增殖的成骨細(xì)胞通過Runx2信號通路分泌骨保護(hù)蛋白（osteprotegerin,OPG）和破骨細(xì)胞分化因子（osteoclast differentiation factor,ODF），二者共同調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的形成[18]，最終使成骨活動和破骨活動達(dá)到動態(tài)平衡，維持骨的正常形態(tài)和功能，實現(xiàn)骨重建。我們的研究結(jié)果顯示，維生素D在短時間（24 h）內(nèi)促進(jìn)細(xì)胞增殖，但 ALP活性、Runx2 mRNA和Osterix mRNA表達(dá)增加不明顯，這可能與維生素D對成骨細(xì)胞的影響與細(xì)胞的成熟程度有關(guān)[19]，同時，提示維生素D對成骨細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用可能并非通過Runx2信號通路實現(xiàn)，與文獻(xiàn)報道一致。但另有結(jié)果提示維生素D抑制其增殖[20]。

我們的研究結(jié)果顯示，維生素D與低濃度GDF11聯(lián)合應(yīng)用對細(xì)胞增殖具有協(xié)同效應(yīng)，而與高濃度GDF11應(yīng)用，則表現(xiàn)為拮抗效應(yīng)。GDF11均能增加ALP活性、Runx2 mRNA和Osterix mRNA表達(dá)，但與維生素D聯(lián)合應(yīng)用后，ALP活性、Runx2 mRNA和Osterix mRNA表達(dá)明顯低于GDF11，可能是GDF11和維生素D對成骨細(xì)胞增殖的信號通路不同，且兩個信號通路之間相互影響，導(dǎo)致Runx2 mRNA和Osterix mRNA表達(dá)減少，但具體機(jī)制尚不明確。

綜上所述，GDF11可提高 Runx2、Osterix mRNA的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞的增殖及提高ALP活性；維生素D促進(jìn)細(xì)胞增殖，可能并非通過Runx2信號通路發(fā)揮作用；維生素D影響了GDF11促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。