李秋實(shí) 王颯 ，王文強(qiáng) ，慕曉玲

（1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院/新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832000；2河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院放射科，河南 開封，475000）

食管癌是目前世界范圍內(nèi)最常見的六大惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在中國最高[1]。腫瘤干細(xì)胞(Cancer stem cells，CSC s)的研究，對腫瘤的臨床診斷和治療有著重要意義，食管腫瘤干細(xì)胞的分離和鑒定是研究食管癌靶向治療的重要途徑。本課題組黃燕燕[2]。通過無血清成球培養(yǎng)法獲得食管癌Eca109細(xì)胞球并觀察了其干細(xì)胞特性及p75NTR表達(dá)情況，推測細(xì)胞球中p75NTR核表達(dá)陽性的球細(xì)胞有可能是食管癌干細(xì)胞。但是細(xì)胞球細(xì)胞都是干細(xì)胞，還是仍然是異質(zhì)性細(xì)胞群，未發(fā)現(xiàn)相關(guān)報(bào)道。

本研究從人食管癌細(xì)胞株Eca109細(xì)胞中分離培養(yǎng)出不同代次的細(xì)胞球細(xì)胞，觀察p75NTR和Ki67的表達(dá)，并對其增殖和侵襲能力進(jìn)行分析，為進(jìn)一步證實(shí)細(xì)胞球細(xì)胞是癌干細(xì)胞以及p75NTR核陽性表達(dá)的球細(xì)胞是食管癌干細(xì)胞提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人食管鱗癌細(xì)胞系Eca109細(xì)胞 (中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)；DMEM/F12無血清培養(yǎng)基、高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和胰酶 (GBICO公司)；B27(Invitrogen公司)，兔抗人p75NTR、Ki67單克隆抗體(abcom公司)；山羊抗鼠IgG-FITC二抗、山羊抗兔IgG-TRITC二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；Cell Counting Kit-8(日本同仁化學(xué)研究所CCK-8試劑盒)；1.2 μm孔徑 Matrigel Matrix基質(zhì)膠 (BD公司)；24 孔 Tanswell小室 (Millipore公司)；LSM-510 激光共聚焦顯微鏡(德國CarlZeiss公司)。

1.2 方法

選取對數(shù)生長期的食管癌Eca109細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。顯微鏡下觀察細(xì)胞密度達(dá)80%以上時(shí)，即可傳代。

1.2.1 細(xì)胞球細(xì)胞的獲得

選用添加有B27(1∶50)的無血清培養(yǎng)基DMEM/F12，選用對數(shù)生長期的食管癌鱗癌Eca109細(xì)胞，消化、離心，加入無血清DMEM/F12培養(yǎng)基稀釋成1×105/mL的單細(xì)胞懸液種入培養(yǎng)瓶中，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待食管癌Eca109細(xì)胞形成連接緊密、體積較大的懸浮的細(xì)胞球時(shí)，再次進(jìn)行傳代。將實(shí)驗(yàn)所需代次細(xì)胞球移入含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，這樣有血清和無血清交替培養(yǎng)3次。取仍能在有血清高糖DMEM培養(yǎng)基中貼壁的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。觀察實(shí)驗(yàn)所需代次細(xì)胞球細(xì)胞的成球數(shù)量并計(jì)算成球率。

1.2.2 熒光免疫細(xì)胞化學(xué)檢測p75NTR、Ki67的表達(dá)

取對數(shù)生長期的細(xì)胞，消化、離心，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基重懸，制成8×103/mL單細(xì)胞懸液，種入預(yù)先準(zhǔn)備好的蓋玻片上，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出蓋玻片，4%的多聚甲醛固定20 min。1×PBS沖洗后滴加山羊封閉液37℃封閉30 min，加入一抗后4℃孵育過夜。次日，37℃復(fù)溫30 min，滴加熒光二抗室溫孵育2 h，最后抗熒光淬滅封片劑封片。采用激光共聚焦顯微鏡來觀察著色部位及熒光強(qiáng)度。

1.2.3 CCK8法測細(xì)胞增殖情況

將對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行消化、離心，稀釋成1×105/mL的單細(xì)胞懸液，在96孔板中每孔接種100 μL稀釋好的細(xì)胞懸液，設(shè)空白對照組，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，每孔加10 μL CCK8液，培養(yǎng)2 h。在酶聯(lián)免疫檢測儀上450 nm波長處檢測各孔的吸光度值(OD值)，記錄結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并描繪其生長曲線。

1.2.4 Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

Matrigel基質(zhì)膠用無血清高糖DMEM培養(yǎng)基按1∶8稀釋包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃過夜風(fēng)干；37℃預(yù)溫?zé)o血清高糖DMEM培養(yǎng)基30 min，用無血清高糖DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/mL，上室加100 μL細(xì)胞懸液，下室加入600 μL含20%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h；使用棉簽輕輕擦拭，擦去上室內(nèi)的細(xì)胞和基質(zhì)膠，在4%的多聚甲醛中固定20 min，風(fēng)干，結(jié)晶紫染色30 min，用光學(xué)顯微鏡觀察計(jì)數(shù)(每個(gè)小室隨機(jī)選取5個(gè)200×視野的細(xì)胞)。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 不同代次細(xì)胞球的特點(diǎn)

將食管癌Eca109細(xì)胞接種于添加B27的無血清DMEM/F12培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)，至第8～11天獲得一定數(shù)量又大又圓的細(xì)胞球。收集生長良好的細(xì)胞球，打散、離心制成單細(xì)胞懸液進(jìn)行傳代培養(yǎng)，仍能得到一定數(shù)量的細(xì)胞球。如此循環(huán)得到第2代直至第9代干細(xì)胞球樣細(xì)胞(圖1)。同時(shí)，觀察并記錄每代細(xì)胞球形成的時(shí)間及細(xì)胞球的大小，我們發(fā)現(xiàn)不同代次細(xì)胞球形成的時(shí)間均在8～11 d，細(xì)胞球的大小也無顯著性差異(P＞0.05)。但是第1代、3代、5代細(xì)胞球形成的數(shù)量隨代數(shù)的增長依次遞增(P＜0.05)，而第5代、7代、9代的細(xì)胞球形成數(shù)量差異不明顯(P＞0.05)(圖2)。

圖1 食管癌Eca109細(xì)胞球的形態(tài)Fig.1 The shape of cell sphere from the esophageal

圖2 不同代次細(xì)胞球細(xì)胞成球能力Fig.2 The spheres formation in different passages cells mammospheres

2.2 不同代次細(xì)胞球細(xì)胞表達(dá)p75NTR和Ki67情況

采用細(xì)胞免疫熒光法檢測食管癌Eca109貼壁細(xì)胞和不同代次食管癌Eca109細(xì)胞球細(xì)胞中干細(xì)胞標(biāo)記物P75NTR、Ki67的定位表達(dá)。兩種蛋白在細(xì)胞上均有表達(dá)，Ki67在食管癌Eca109細(xì)胞和不同代次細(xì)胞球細(xì)胞中都定位于細(xì)胞核。其中p75NTR在食管癌Eca109貼壁細(xì)胞中熒光大部分定位于細(xì)胞漿，小部分定位于細(xì)胞核 (圖3A～3D)。在第1代、3代、5代細(xì)胞球細(xì)胞中熒光定位于細(xì)胞核的數(shù)量隨代數(shù)的增長依次遞增(圖 3E～3P)。第5代、7代、9代所有細(xì)胞均是p75NTR核陽性表達(dá)(圖3M～3X)。

圖3 Eca109細(xì)胞、不同代數(shù)Eca109細(xì)胞球p75NTR(綠)、Ki67(紅)、DAPI（藍(lán)）的表達(dá)(×200)Fig.3 Expression of p75NTR(green)、Ki67(red)and DAPI（blue）in different passages cells mammospheres(×200)

2.3 不同代次細(xì)胞球細(xì)胞增殖能力

與食管癌Eca109貼壁細(xì)胞相比，不同代次食管癌Eca109細(xì)胞球具有更強(qiáng)的增殖能力(P＜0.05)，隨著食管癌Eca109細(xì)胞球代數(shù)的增長，細(xì)胞球第1代，3代，5代細(xì)胞的增殖能力依次遞增(P＜0.05)，但是第5代之后的增殖能力并無顯著差異(P＞0.05)(圖4)。

圖4 Eca109細(xì)胞、不同代數(shù)Eca109細(xì)胞球增殖情況Fig.4 Cell proliferation in different passages cells mammospheres

2.4 不同代次細(xì)胞球細(xì)胞的侵襲能力

細(xì)胞侵襲能力的大小與穿過Matrigel基質(zhì)膠到達(dá)濾膜的細(xì)胞數(shù)成正比，結(jié)果見（圖5，圖6）。

圖5 不同代數(shù)Eca109細(xì)胞球Transwell侵襲能力Fig.5 Different passage cell mammospheres Transwell invasion assay

圖6 不同代數(shù)Eca109細(xì)胞球Transwell侵襲能力統(tǒng)計(jì)結(jié)果Fig.6 The statistical results of different passage cell mammospheres Transwell invasion assay

不同代次細(xì)胞球的穿膜細(xì)胞數(shù)量均顯著多于食管癌Eca109貼壁細(xì)胞(P＜0.05)，隨著食管癌Eca109細(xì)胞球代數(shù)的增長，穿膜的細(xì)胞數(shù)量依次遞增，但是食管癌Eca109細(xì)胞球第5代之后穿膜的細(xì)胞數(shù)量并無顯著差異(P＞0.05)。

3 討論

已有研究結(jié)果表明，多種腫瘤細(xì)胞系中存在腫瘤干細(xì)胞。人們發(fā)現(xiàn)，腫瘤干細(xì)胞具有很強(qiáng)的分化和增殖能力，并與腫瘤的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移等過程密切相關(guān)[3-9]。腫瘤干細(xì)胞對腫瘤的研究具有重要的意義。迄今為止，人們已從多種實(shí)體腫瘤中分離并鑒定出了腫瘤干細(xì)胞，包括白血病[10]、腦腫瘤[11]、肺癌[12]、乳腺癌[13]、惡性黑素瘤[14]、前列腺癌[15]等，但對食管癌干細(xì)胞的分離鑒定尚待研究。

廣泛應(yīng)用的增殖細(xì)胞標(biāo)記物Ki67是反映細(xì)胞增殖的指標(biāo)，是一種與細(xì)胞增殖相關(guān)的核抗原[16]。Ki67在細(xì)胞的靜止期不表達(dá)，僅表達(dá)在細(xì)胞的增殖階段，Ki67高表達(dá)的細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖能力，可以促使腫瘤的發(fā)生。在多種癌前病變及腫瘤中Ki67的表達(dá)異常與多種腫瘤的增殖、浸潤、轉(zhuǎn)移潛能密切相關(guān)。

p75NTR，是分子量為75Da的蛋白受體，是Ⅰ型跨膜TNF超家族成員。Okumura[17]于2003年研究發(fā)現(xiàn)，p75NTR陽性細(xì)胞可能是食管上皮干細(xì)胞，正常食管上皮p75NTR陽性表達(dá)的細(xì)胞具有干細(xì)胞特性。隨后，人們發(fā)現(xiàn)將食管癌中p75NTR的表達(dá)下調(diào)，會出現(xiàn)癌細(xì)胞的增殖抑制或凋亡。這些研究提示我們，食管癌細(xì)胞中p75NTR陽性表達(dá)的細(xì)胞相比p75NTR陰性表達(dá)的細(xì)胞可能富集更多的腫瘤干細(xì)胞。本課題組許健[18]用三氧化二砷對食管癌TE-1細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)發(fā)現(xiàn)，食管癌TE-1細(xì)胞中p75NTR核表達(dá)陽性的細(xì)胞減少，認(rèn)為p75NTR核表達(dá)陽性的食管癌細(xì)胞可能是食管癌干細(xì)胞。黃燕燕[2]通過無血清成球培養(yǎng)法獲得食管癌Eca109細(xì)胞球并觀察了其干細(xì)胞特性及p75NTR表達(dá)情況，結(jié)果表明細(xì)胞球中p75NTR核表達(dá)陽性的細(xì)胞可能為食管癌干細(xì)胞。

當(dāng)前對食管癌干細(xì)胞的研究，還處于早期階段。能夠獲得穩(wěn)定的食管癌干細(xì)胞，是研究食管癌干細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制的必備條件。本研究中，我們運(yùn)用無血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)法，可以有效地富集到食管癌干細(xì)胞球樣細(xì)胞，這種技術(shù)操作簡便，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好[19-20]。這種方法形成的食管癌干細(xì)胞球樣細(xì)胞擁有與腫瘤干細(xì)胞相似的特性。許立生[21]等研究發(fā)現(xiàn)，將乳腺癌MCF-7細(xì)胞球消化再傳代可再形成細(xì)胞球，如此重復(fù)之后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞總數(shù)可大量擴(kuò)增。楊東[22]等將結(jié)腸癌干細(xì)胞球傳代培養(yǎng)，并對比不同代次細(xì)胞球的成球率，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌干細(xì)胞球第二代、三代的成球率明顯高于第一代，第二代、第三代成球率未見明顯差異。但是關(guān)于腫瘤細(xì)胞球體外更高代次的傳代以及傳代后其表型改變未有具體描述。為了更好地了解不同代次食管癌細(xì)胞球的表型改變，本實(shí)驗(yàn)用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，得到第1代的食管癌干細(xì)胞球樣細(xì)胞后對其進(jìn)行傳代，得到第2代直至第9代干細(xì)胞球樣細(xì)胞，并觀察每代細(xì)胞球細(xì)胞形成的時(shí)間、大小以及數(shù)量。為了更好的篩選出腫瘤干細(xì)胞，取實(shí)驗(yàn)用第1代、3代、5代、7代、9代的細(xì)胞球細(xì)胞，用含血清和無血清兩種培養(yǎng)基交替培養(yǎng)3次，收獲仍能貼壁的細(xì)胞，檢測細(xì)胞特異性標(biāo)志物Ki67和p75NTR的表達(dá)情況，并對其增殖、侵襲能力進(jìn)行對比。

所得結(jié)果顯示:每代細(xì)胞球形成的時(shí)間、大小無明顯差異，但第1代、3代、5代細(xì)胞球形成的數(shù)量隨代數(shù)的增長依次遞增，而第5代、7代、9代的細(xì)胞球形成數(shù)量差異不明顯。另外，第1代、3代、5代細(xì)胞球細(xì)胞中p75NTR核表達(dá)陽性的細(xì)胞數(shù)量隨細(xì)胞球代數(shù)的增長依次遞增，增殖、侵襲能力都隨之相應(yīng)增強(qiáng)；第 5代、7代、9代細(xì)胞球細(xì)胞均是p75NTR核陽性表達(dá)，同時(shí)第5代、7代、9代細(xì)胞球細(xì)胞的增殖能力、侵襲能力均未見顯著差異。結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)第5代、7代、9代細(xì)胞球細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖能力、侵襲能力。

綜上所述，細(xì)胞球形成實(shí)驗(yàn)是一個(gè)比較可靠的腫瘤干細(xì)胞評價(jià)指標(biāo)，多次傳代后的細(xì)胞球細(xì)胞基本完全純化為腫瘤干細(xì)胞。我們的結(jié)果也進(jìn)一步證明p75NTR核陽性表達(dá)細(xì)胞可能是食管癌干細(xì)胞。