劉馨馨 ，趙丹 ，陳亞茹 ，楊曉萍 ，黃瑾 ，羅星 *

（1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆 石河子832002；2石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，新疆 石河子832002）

慢性腎臟病(chronic kidney disease,CKD)是一種以腎小球為主的腎臟微結(jié)構(gòu)變化為主要特征的腎功能日漸喪失的臨床常見慢性疾病。目前CKD已成為一個日益增長的全球公共衛(wèi)生問題，全球慢性腎臟病患病率大約為8%～16%，相當(dāng)于近5億患者受慢性腎病的影響[1]，估算到2020年5000萬人將死于慢性腎臟疾病[2]。CKD階段的評估可以幫助患者根據(jù)其腎功能惡化的風(fēng)險進行分層，蛋白尿是腎病發(fā)展進程的診斷和治療目標(biāo)，且蛋白尿和微量元素的丟失是評判慢性腎病的有效指標(biāo)，足細胞病變和足細胞凋亡是導(dǎo)致大量蛋白尿的重要組織病理學(xué)改變[3]。足細胞裂孔隔膜蛋白nephrin的缺失是足細胞損傷的早期生物標(biāo)志，用于預(yù)測預(yù)后不良[4]。研究表明，針對足細胞不同的損傷路徑，選擇合適的治療方案是實現(xiàn)治療慢性腎病的精密醫(yī)學(xué)目標(biāo)。因此解決慢性腎臟病腎臟損傷這一問題的關(guān)鍵是探索有效的治療足細胞損傷的方法，以減輕腎損傷并防止其進展至終末期腎病[5]。

1,25-(OH)2D3被稱為“陽光維生素”，是維持人體生命所必需的營養(yǎng)素之一，人體內(nèi)的1,25-(OH)2D3與許多疾病的發(fā)病機制密切相關(guān)，近年來，1,25-(OH)2D3在免疫功能、炎癥、血管生成和衰老等方面的重要作用已經(jīng)得到證實，甚至在乳腺癌、結(jié)直腸癌等癌癥中有抗腫瘤作用[6-7]。細胞內(nèi)特異性維生素D受體介導(dǎo)在1,25-(OH)2D3的生物學(xué)效應(yīng)中承擔(dān)著重要的作用[8]。臨床研究和動物實驗表明在慢性腎臟病早期就存在1,25-(OH)2D3的產(chǎn)生和分泌降低,其分泌降低又進一步加重了腎功能損害,從而行成惡性循環(huán)[9]。

隨著1,25-(OH)2D3生物學(xué)效應(yīng)研究受到越來越多研究學(xué)者的青睞，其在腎小球疾病的保護作用得到進一步認識，因而,早期補充1,25-(OH)2D3可能是有效延緩慢性腎臟病進展的有效策略之一。

本研究利用阿霉素來誘導(dǎo)SD大鼠，建立慢性腎病動物模型，造模成功后給予活性維生素D3干預(yù)，觀察其在動物模型中對阿霉素導(dǎo)致的足細胞和腎損傷的保護作用，并驗證其是否通過調(diào)節(jié)nephrin蛋白表達發(fā)揮這種作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要藥品與試劑

注射用鹽酸多柔比星：浙江Hisun藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H20041318，規(guī)格：10 mg/支。骨化三醇膠丸：上海羅氏制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字J20150011，規(guī)格 0.25 μg/粒。水合氯醛（分析純）：天津市福晨化學(xué)試劑廠，批號20130412。nephrin一抗：美國abcam公司，產(chǎn)品代碼ab183099。免疫組化二步法檢測試劑盒：北京中杉金橋生物有限公司，產(chǎn)品代碼PV-9000。

1.1.2 儀器

TGL-16B離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠；AU640全自動生化分析儀：日本Olympus公司；GL124-1SCN電子秤：德國Sartorius公司；H-600透射電子顯微鏡：日本日立公司；BX43光學(xué)顯微鏡：日本Olympus公司。

1.1.3 實驗動物

6周齡 SPF級雄性成熟 SD大鼠（200-220g）90只，由新疆醫(yī)科大學(xué)動物中心提供[許可證號：SCXK（新）2013-0001]。

1.2 方法

1.2.1 分組及阿霉素腎病大鼠模型制備

將90只雄性SD大鼠隨機分為模型組、治療組和對照組，每組30只。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，模型組和治療組按7.5 mg/kg體重的劑量，一次性尾靜脈注射ADR溶液（ADR溶液用無菌生理鹽水配制濃度為2 mg/mL，且無絮狀物漂浮），建立阿霉素大鼠腎病動物模型；對照組注射與阿霉素溶液等量的生理鹽水。

1.2.2 給藥

治療組在建立阿霉素腎病模型前兩天開始，每天給予1,25(OH)2D3灌胃，劑量為 0.25 μg/kg，對照組和模型組每天給予等量的花生油灌胃。治療過程中大鼠自由飲食。

1.2.3 體重、血、尿檢測

檢測各組大鼠每周體重變化。分別于注射ADR溶液后第 2、4、6、8、10周處死大鼠，每組各 6只。處死前一天留取24 h尿液，進行24 h尿蛋白定量檢驗；腹主動脈采血檢測 TP、Alb、BUN、Cre、TC。10%水合氯醛腹腔注射麻醉（麻醉劑量：0.35 mL/100 g），剖開腹腔快速剝離雙腎并去除腎被膜，同時測量腎重，計算腎臟系數(shù)。（腎臟系數(shù)=雙腎重/體重）。

1.2.4 電鏡

取腎皮質(zhì)1mm，依次用2.5%戊二醛、1%鋨酸固定后行電鏡（transmission electron microscope,TEM）檢查。觀察足細胞形態(tài)變化。

1.2.5 免疫組化

4微米腎組織石蠟切片常規(guī)脫蠟脫水，枸櫞酸緩沖液（pH6.0）高溫進行抗原修復(fù)，3%過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物酶，滴加nephrin大鼠抗體(美國abcam，1∶100)4℃過夜，次日滴加增強酶標(biāo)IgG并于37℃溫箱孵育30 min，然后依次進行顯色、復(fù)染、封片。組織切片光鏡下觀察，陽性表達部位顯示棕黃色，每張片子隨機選取5個不重疊視野（×400），應(yīng)用醫(yī)學(xué)圖像分析軟件ImageProPlus 6.0半定量分析法評估nephrin蛋白的表達，以高倍視野下陽性表達的平均光密度值(AOD)表示其相對含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 造模后大鼠體征觀察

對照組大鼠體形豐滿，體重平穩(wěn)增加，被毛濃密有光澤，飲食及排便均正常。模型組大鼠消瘦，體重降低，蜷縮好臥，與對照組相比反應(yīng)遲鈍、精神萎靡不振，被毛粗糙無光易脫落，進食量和排便量減少。與模型組比較，治療組大鼠精神狀態(tài)、反應(yīng)及毛色均明顯改善。

2.2 1,25-(OH)2D3對阿霉素腎病大鼠體重的影響

初始體重都在250 g左右，隨著培養(yǎng)周數(shù)的增加，對照組從250 g增加到450 g，模型組生長緩慢，體重增加的最少，而治療組開始體重增加的也相對緩慢，到5周以后基本與對照組增重速度相同（圖 1）。

2.3 1,25-(OH)2D3對阿霉素腎病大鼠腎臟系數(shù)的影響

模型組大鼠各時間點腎臟系數(shù)與對照組同一時期相比均有所升高（P＜0.05）。與模型組比較，治療組大鼠同時間腎臟系數(shù)下降（P＜0.05）（圖2）。

圖1 各組大鼠體重變化Fig.1 Weight changes of rats in each group

圖2 各組大鼠腎臟系數(shù)比較Fig.2 Comparison on kidney index of rats in each group

2.4 1,25-(OH)2D3對阿霉素腎病大鼠24 h UTP的影響

與對照組比較，模型組24 hUTP顯著上升，并持續(xù)升高（P＜0.05），表明模型復(fù)制成功。經(jīng)1,25-(OH)2D3治療后，SD大鼠尿蛋白水平逐漸降低，治療至第6周末時，大鼠24 h UTP水平與模型組比較，顯著下降（P＜0.05），至第 10周末時，24 h UTP水平降低至接近正常水平。（圖3）。

圖3 各組大鼠24 h尿蛋白定量比較Fig.3 Comparison on 24h urine total protein of rats in each group

2.5 1,25-(OH)2D3對阿霉素腎病大鼠血生化影響

第10周末各組大鼠生化指標(biāo)：與對照組相比，模型組大鼠同一時期Cre、BUN、TC含量顯著升高（P＜0.05），TP、Alb顯著降低（P＜0.05）。與模型組相比，治療組大鼠同一時期Cre、BUN、TC含量顯著下降（P＜0.05），TP、Alb含量顯著上升（P＜0.05），治療至第 10周末時，SD大鼠血清 Cre、TC、TP、Alb恢復(fù)接近至正常水平，血清BUN明顯降低，但仍明顯高于對照組（表1）。

表1 10周末各組大鼠血生化指標(biāo)比較Tab.1 Comparision on blood biochemical indexes of rats in each group at the end of 10 weeks

2.6 電鏡觀察1,25-(OH)2D3對阿霉素腎病大鼠腎組織病理學(xué)影響

對照組大鼠腎外觀呈紅褐色，觸之平滑柔軟。模型組大鼠腎外觀呈蒼白色，被膜緊張；與模型組比較，治療組大鼠上述病理學(xué)改變均有好轉(zhuǎn)，質(zhì)地紅潤，水腫程度減輕。

大鼠腎組織透射電鏡觀察結(jié)果顯示，對照組大鼠足細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，基底膜平滑均勻無增厚，足突結(jié)構(gòu)清晰完整。模型組大鼠足細胞變扁平，基底膜出現(xiàn)增厚，足突廣泛融合，胞質(zhì)內(nèi)微絲聚集成斑塊狀；部分區(qū)域可見足突從基底膜脫落，足細胞數(shù)減少、甚至消失。與模型組比較，治療組上述病變有不同程度減輕，可見足細胞數(shù)恢復(fù)，足突融合輕微，基底膜無明顯增厚（圖4）。

圖4 1,25-(OH)2D3對阿霉素腎病大鼠腎組織超微結(jié)構(gòu)改變影響（TEM,×4000）Fig.4 Effect of 1,25-(OH)2D3on ultrastructural changes in kidney tissue of rats with adriamycin-induced nephropathy

2.7 1,25-(OH)2D3對阿霉素腎病大鼠腎組織nephrin蛋白表達的影響

免疫組織化學(xué)染色顯示，nephrin陽性物質(zhì)鏡下呈棕黃色顆粒，主要表達于細胞腎小球足細胞膜。對照組大鼠腎小球可見nephrin蛋白表達量高，在毛細血管襻中呈現(xiàn)連續(xù)、粗線樣的分布。模型組僅少量nephrin蛋白表達，黃色沉積逐漸變淡、消失。治療組較模型組有所改善，第10周末治療組陽性表達率明顯高于模型組（P＜0.05），腎小球中黃色沉積逐漸增加，至淡黃色或黃褐色連續(xù)粗線樣分布（圖5）。

圖5 第10周末1,25-(OH)2D3對阿霉素腎病大鼠腎組織nephrin蛋白表達影響（IHC，×400）Fig.5 Effect of 1,25(OH)2D3on expression of nephrin protein of rats with adriamycin-induced nephropathy at the end of 10 weeks(IHC,×400)

3 討論

慢性腎臟病是指由糖尿病腎病，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，淀粉樣變，癌癥和藥物等多種致病因素引起的腎臟結(jié)構(gòu)和功能異常[10-11]。本研究利用以腎小球損傷為主的阿霉素腎病大鼠模型，其制備方法簡單易操控。結(jié)果顯示，大鼠給予阿霉素干預(yù)2周后，與對照組相比血清中肌酐、尿素氮、膽固醇含量均明顯增加，血清白蛋白、總蛋白降低,（P＜0.05），表明模型構(gòu)建成功[12]。

足細胞是腎臟腎小球高度特化的樹狀上皮細胞，臨近波曼氏囊，包裹著毛細血管。當(dāng)涉及到腎小球濾過時，足細胞通過提供包括相互交錯的足突，以及足突之間的裂隙隔膜在內(nèi)的過濾屏障，在血漿蛋白進入尿超濾液時發(fā)揮著重要作用[13]。腎小球濾過障礙是終末期腎功能衰竭的主要原因，在HFD/STZ誘導(dǎo)的糖尿病腎病模型中，小鼠出現(xiàn)明顯的蛋白尿和腎小球損傷[14]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，足細胞損傷可作為糖尿病腎病早期的重要病理特征[15]。nephrin特異性表達于腎小球足細胞裂隙隔膜，在維持腎小球正常發(fā)育和功能方面發(fā)揮著重要作用，其表達的降低是導(dǎo)致足細胞損傷的重要原因[16]，敲除成年小鼠的nephrin基因，加重了單側(cè)腎切除術(shù)和阿霉素誘導(dǎo)的腎病的進展[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，ADR誘導(dǎo)大鼠自第2周至實驗結(jié)束10周時較對照組相比蛋白尿水平逐漸增加，腎組織nephrin蛋白的表達含量也明顯下調(diào)；電鏡結(jié)果顯示ADR大鼠足細胞突起生長抑制，發(fā)生融合甚至脫落，基底膜出現(xiàn)不同程度的增厚，與文獻報道一致。由此可知，足細胞損傷特別是足細胞標(biāo)記蛋白分子nephrin的丟失，與ADR大鼠足細胞損傷以及蛋白尿的形成密切相關(guān)。

研究表明維生素D3及其類似物可以顯著降低CKD患者包括糖尿病腎病患者的蛋白尿[18-19]。最近的一項研究結(jié)果提示在急性腎損傷患者中活性維生素D3的缺乏是患者預(yù)后的獨立危險因素[20]。在多種動物模型包括5/6腎大部切除、STZ以及高糖誘導(dǎo)的腎病模型中發(fā)現(xiàn)給予維生素D類似物可以明顯降低蛋白尿，減輕腎小球足細胞損傷[21-23]。與以往文獻報道一致，本研究同樣也發(fā)現(xiàn)維生素D3具有降低ADR大鼠尿蛋白水平的作用，并且能夠減輕ADR大鼠足細胞足突融合脫落以及基底膜增生，表明其通過維持并恢復(fù)分化的足細胞表型來發(fā)揮其重要作用。免疫組化結(jié)果進一步發(fā)現(xiàn)，維生素D3逆轉(zhuǎn)了足細胞nephein蛋白表達的下降。這些結(jié)果表明維生素D3能夠促進ADR大鼠足細胞損傷修復(fù)，但其具體作用機制仍需深入探討。

由此可見，腎小球足細胞受損導(dǎo)致出現(xiàn)蛋白尿是阿霉素腎病早期的典型病理、臨床特征?；钚跃S生素D3能夠增加阿霉素腎病模型大鼠的體重、改善生存狀態(tài)；使nephrin蛋白表達恢復(fù)接近正常水平，從而降低蛋白尿水平，對阿霉素腎病模型大鼠腎功能損傷有修復(fù)作用；對構(gòu)成腎小球濾過屏障的足細胞有促進恢復(fù)的作用。該結(jié)果提示足細胞是活性維生素D3發(fā)揮腎臟保護作用的重要靶細胞，并且可能是通過上調(diào)nephrin蛋白的表達，來修復(fù)足細胞的損傷以及防止足細胞數(shù)目的減少，了解其涉及的分子水平機制將有助于活性維生素D3在慢性腎病治療中的應(yīng)用。