王 蕊， 李彥慧， 鄭 健

(1. 北京農(nóng)學院園林學院 北京林果業(yè)生態(tài)環(huán)境功能提升協(xié)同創(chuàng)新中心， 北京 102206； 2. 河北農(nóng)業(yè)大學園林與旅游學院， 河北 保定 071000)

黃酮類化合物是一類重要的植物次生代謝產(chǎn)物，在植物花色形成過程中具有重要作用。查爾酮異構酶(chalcone isomerase，CHI)在黃酮類化合物的合成過程中起關鍵作用，能夠催化查爾酮異構化為4，5，7-三羥基黃烷酮(naringenin)，并在其他酶的催化作用下形成不同的黃酮類化合物[1]。1967年，Moustafa等[2]首先從大豆〔Glycinemax(Linn.) Merr.〕中純化獲得第1個CHI蛋白；20年后，Mehdy等[3]首次從菜豆(PhaseolusvulgarisLinn.)中克隆獲得CHI基因的cDNA序列；隨后，研究人員從玉米(ZeamaysLinn.)[4]、碧冬茄〔Petuniahybrida(J. D. Hook.) Vilm.〕[5]、銀杏(GinkgobilobaLinn.)[6]、番薯〔Ipomoeabatatas(Linn.) Lam.〕[7]和金魚草(AntirrhinummajusLinn.)[8]等植物中均克隆到CHI基因。近年來，通過基因工程技術調(diào)控CHI基因表達、改變植物花色的研究屢見報道[9-11]，對于觀花植物花色育種具有重要意義。

紫丁香(SyringaoblataLindl.)又名華北紫丁香，隸屬于木犀科(Oleaceae)丁香屬(SyringaLinn.)，為落葉灌木。紫丁香適應性強，耐寒、耐旱、耐瘠薄，病蟲害較少，并具有花序碩大、開花繁茂及花色和花香獨特等特點，是一種極具觀賞價值的園林植物；該種可孤植、對植或片植，常作為公園、庭園和街頭綠地的觀花灌木廣泛應用于中國北方園林綠化。目前，關于紫丁香的研究主要集中在花期[12]、繁育技術[13]和抗逆生理[14]等方面，而關于其花色的研究尚處于起步階段，僅見關于紫丁香花色素生物合成相關基因[15]的研究報道以及肉桂酸4-羥化酶基因(SoC4H)時空表達模式[16]的研究報道。實際上，紫丁香花擁有從淺粉色到紫色再到深紫色等多種顏色，然而關于其花呈色的分子機制尚未清楚，阻礙了紫丁香花色育種研究進展。

為了探明紫丁香花色形成的分子機制，作者采用RACE技術從紫丁香花中克隆獲得CHI基因的cDNA全長序列，對該基因編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、氨基酸序列同源性以及結構和功能進行了分析，并采用實時熒光定量PCR技術對該基因在紫丁香不同器官和花期的表達特性進行了研究，以期明確紫丁香花色形成的分子機制，為利用基因工程技術培育紫丁香新品種提供理論基礎和備選基因。

1 材料和方法

1.1 材料

在北京農(nóng)學院林木種質(zhì)資源圃內(nèi)選擇生長健壯且無病蟲害的紫丁香植株，采集葉片和花，置于-80℃冰箱中保存，分別用于總DNA和總RNA的提取；在該種質(zhì)資源圃中隨機選擇3株生長健壯且無病蟲害的紫丁香植株，在東、南、西、北4個方向分別采集嫩枝、嫩葉、成熟葉、花和根，并在花芽期、花蕾期、初花期、盛花期和末花期采集樣株的花，單株樣品混勻后置于-80℃冰箱中保存，分別用于不同器官和花期紫丁香CHI基因的表達特性分析。

實驗使用的RNA提取試劑盒、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、2×EasyTaq? PCR SuperMix、質(zhì)粒提取試劑盒、pEASY-T載體和大腸桿菌菌株DH5α感受態(tài)細胞均購自北京全式金生物技術有限公司，切膠回收試劑盒和SYBR?PremixExTaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)購自寶生物工程(大連)有限公司，3′RACE和5′RACE試劑盒購自北京百泰克生物技術有限公司；引物合成及測序工作均由北京三博遠志生物技術有限責任公司完成。

1.2 方法

1.2.1 紫丁香CHI基因的克隆 參照李榮華等[17]的改良CTAB法提取紫丁香葉片的總DNA。

使用RNA提取試劑盒，按照說明書操作流程提取紫丁香花的總RNA；按照RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書上的操作流程將提取的總RNA進行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA第1條鏈。使用BLASTn軟件(https：∥blast. ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，將Zheng等[15]測序獲得的紫丁香CHI基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中其他植物的CHI基因序列進行比對，確定CHI基因的保守區(qū)；根據(jù)該基因的保守區(qū)序列設計引物SoCHI-1F和SoCHI-1R

(引物序列分別為 5′-T￣T￣G￣G￣A￣A￣C￣C￣T￣A￣C￣A￣C

C￣G￣A￣T￣G￣C￣T-3′和5′-A￣A￣C￣A￣C￣C￣G￣T￣G￣C￣T￣T￣G￣C￣C￣A￣A￣T￣T￣A-3′)，以cDNA第1條鏈為模板進行擴增反應，獲得紫丁香CHI基因cDNA序列的中間片段；設計3′RACE引物SoCHI-2F和SoCHI-3F(引物序列分別為5′-C￣C￣A￣G￣A￣A￣T￣C￣C￣G￣G￣G￣A￣A￣T￣G￣C￣A￣G￣T￣T￣A￣T￣A￣T￣A￣G-3′和5′-C￣G￣G￣A￣A￣G￣C￣A￣G￣T￣G￣C￣T￣G￣C￣A￣G￣T￣C￣T￣A￣T￣A￣A￣T￣T￣G￣G￣C-3′)，以cDNA第1條鏈為模板，使用3′RACE試劑盒進行擴增反應，獲得紫丁香CHI基因cDNA序列的3′端片段；設計5′RACE引物SoCHI-2R和SoCHI-3R(引物序列分別為5′-G￣G￣A￣A￣A￣G￣T￣T￣T￣C￣G￣T￣T￣C￣T￣T￣G￣A￣A￣G￣A￣C￣C-3′和5′-C￣T￣C￣C￣A￣A￣G￣A￣A￣C￣T￣T￣T￣T￣C￣A￣A￣T￣T￣G￣C￣T￣T￣T￣A￣G￣A￣C-3′)，以cDNA第1條鏈為模板，使用5′RACE試劑盒進行擴增反應，獲得紫丁香CHI基因cDNA序列的5′端片段。擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測、膠回收、連接載體、轉(zhuǎn)化大腸桿菌、檢測陽性克隆和測序后，使用DNAMAN 7.0軟件將擴增獲得的紫丁香CHI基因cDNA序列的中間片段、3′端片段和5′端片段進行拼接，獲得紫丁香CHI基因的cDNA全長序列。

設計能夠擴增出紫丁香CHI基因的完整開放閱讀框(ORF)的引物SoCHI-4F和SoCHI-4R(引物序列分別為5′-A￣T￣G￣T￣C￣T￣T￣T￣G￣T￣C￣G￣C￣C￣G￣A￣C￣C￣G￣T-3′和5′-T￣C￣A￣A￣T￣T￣T￣G￣G￣C￣A￣C￣G￣G￣T￣G￣G￣C￣C￣T-3′)，分別以cDNA第1條鏈和總DNA為模板進行擴增反應，擴增體系總體積20.0 μL，包括cDNA第1條鏈或總DNA 1.0 μL，上游引物和下游引物各0.4 μL，2×EasyTaq?PCR SuperMix 10.0 μL，ddH2O 8.2 μL。擴增程序為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸2 min，共30個循環(huán)反應；72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測、膠回收、連接載體、轉(zhuǎn)化大腸桿菌和檢測陽性克隆后進行測序。

1.2.2 紫丁香CHI基因序列分析及編碼蛋白質(zhì)特性分析 使用DNAMAN 7.0軟件尋找紫丁香CHI基因cDNA序列的開放閱讀框，預測該基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列；使用NCBI(http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)網(wǎng)站中的BLASTp軟件對該基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列進行保守域預測，并與NCBI網(wǎng)站UniProt數(shù)據(jù)庫中其他植物CHI蛋白的氨基酸序列進行同源性比對；使用ExPASy(http：∥www.expasy.org/)網(wǎng)站中的Compute PI/MW tool工具對該基因編碼蛋白質(zhì)的理論相對分子質(zhì)量和理論等電點進行分析；同時，使用GOR4和Swiss-Model軟件分別對該基因編碼蛋白質(zhì)的二級和三級結構進行預測分析。

1.2.3 紫丁香CHI基因的表達特性分析 參照苑笑陽等[18]的方法，以SoActin7為內(nèi)參基因，采用實時熒光定量PCR技術對紫丁香嫩枝、嫩葉、成熟葉、花和根以及花芽期、花蕾期、初花期、盛花期和末花期花中CHI基因的相對表達量進行檢測，每個單株視為1個重復，共3個重復。使用的熒光定量PCR擴增引物為SoCHI-5F 和 SoCHI-5R (引物序列分別為5′-C￣A￣C￣C￣G￣T￣G￣C￣T￣T￣G￣C￣C￣A￣A￣T￣T￣A￣T￣A￣G￣A-3′ 和5′-G￣A￣A￣T￣C￣C￣G￣G基因的相對表達量進行檢測G￣A￣A￣T￣G￣C￣A￣G￣T￣T￣A￣T￣A￣G￣A-3′)，內(nèi)參基因擴增引物為SoActin-7F 和 SoActin-7R(引物序列分別為 5′-T￣G基因的相對表達量進行檢測G￣A￣A￣T￣G￣T￣G￣C￣T￣G￣A￣G￣A￣G￣A￣T￣G￣C-3′ 和5′-T￣G￣C￣T￣G￣A￣C￣C￣G￣T基因的相對表達量進行檢測A￣T￣G￣A￣G￣C￣A￣A￣A￣G-3′)。使用Bio-Rad iQTM5熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)進行擴增反應，擴增體系總體積25.0L，包括cDNA模板1.0L，上游引物和下游引物各1.0L，SYBR?PremixExTaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)12.5L，ddH2O 9.5L。根據(jù)2計算紫丁香CHI基因在不同器官和花期的相對表達量。

2 結果和分析

2.1 紫丁香CHI基因cDNA和gDNA的全長序列分析

擴增結果表明：以紫丁香花中cDNA第1條鏈為模板擴增獲得的紫丁香CHI基因cDNA序列的中間片段長度為247 bp(圖1-A)，通過與NCBI數(shù)據(jù)中的數(shù)據(jù)進行比對，該片段編碼的蛋白質(zhì)與多種植物CHI基因編碼的蛋白質(zhì)的同源性達90%以上；根據(jù)同源特異片段序列分別設計3′RACE和5′RACE特異引物進行擴增，分別獲得紫丁香CHI基因cDNA序列的3′端片段(圖1-B)和5′端片段(圖1-C)，序列長度分別約為270和460 bp；將上述3個片段測序后進行拼接，獲得紫丁香CHI基因的cDNA全長序列，命名為SoCHI。根據(jù)SoCHI基因3′端片段和5′端片段的序列設計引物，分別以紫丁香cDNA第1條鏈和總DNA為模板，擴增獲得該基因cDNA(圖1-D)和gDNA(圖1-E)的全長序列，經(jīng)比對，SoCHI基因的cDNA序列與拼接后得到的cDNA序列一致，并且，該基因無內(nèi)含子，全部由外顯子構成。

分析結果(圖2)表明：SoCHI基因的開放閱讀框(ORF)長度為684 bp，編碼227個氨基酸殘基，編碼的蛋白質(zhì)為SoCHI蛋白。

M： DNA marker； A： 中間片段 Intermediate fragment； B： 3′端片段 3′ terminal fragment； C： 5′端片段 5′ terminal fragment； D： cDNA全長序列 Full-length sequence of cDNA； E： gDNA全長序列 Full-length sequence of gDNA.圖1 紫丁香SoCHI基因的擴增結果Fig. 1 Amplification result of SoCHI gene in Syringa oblata Lindl.

： 底物結合位點 Substrate binding site； □： 氫鍵結合位點 Hydrogen bond binding site； ▲： 活性催化位點 Active catalytic site； *： 終止密碼子 Stop condon.圖2 紫丁香SoCHI基因的cDNA序列及其編碼的氨基酸序列Fig. 2 cDNA sequence of SoCHI gene in Syringa oblata Lindl. and its amino acid sequence encoded

2.2 SoCHI蛋白特性分析

2.2.1 理化性質(zhì)分析 分析結果表明：SoCHI蛋白的理論相對分子質(zhì)量24 988，理論等電點pI 5.53；其氨基酸序列包含21個帶正電荷的氨基酸殘基〔精氨酸(Arg)和賴氨酸(Lys)〕和24個帶負電荷的氨基酸殘基〔天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)〕，并且，絲氨酸(Ser)、Lys、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)和亮氨酸(Leu)含量較高；SoCHI蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為47.58，說明該蛋白質(zhì)屬于不穩(wěn)定蛋白；其平均親水指數(shù)為-0.096，說明該蛋白質(zhì)為親水性蛋白。

2.2.2 氨基酸序列同源性分析 將SoCHI蛋白的氨基酸序列與NCBI網(wǎng)站UniProt數(shù)據(jù)庫中其他植物CHI蛋白的氨基酸序列進行比對，桂花(OsmanthusfragransLour.)、油橄欖(OleaeuropaeaLinn.)、黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr.)、金花茶(CamellianitidissimaChi)、忍冬(LonicerajaponicaThunb.)、金魚草、黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)、芍藥(PaeonialactifloraPall.)和石榴(PunicagranatumLinn.)9種植物與紫丁香CHI蛋白的氨基酸序列相似性較高，同源性比對結果(圖3)表明：紫丁香與同科植物桂花(登錄號為ALL27265.1)和油橄欖(登錄號為AHI86005.1)CHI蛋白的同源性最高，為88%；其與黑果枸杞(登錄號為AHH86092.1)、金花茶(登錄號為ADZ28513.1)、忍冬(登錄號為AGE10599.1)、金魚草(登錄號為BAO32070.1)、黃芩(登錄號為AMW91737.1)、芍藥(登錄號為AEK32592.1)和石榴(登錄號為AHZ97871.1)CHI蛋白的同源性也較高，均在76%以上。

So： 紫丁香 Syringa oblata Lindl.； Of： 桂花 Osmanthus fragrans Lour.； Oe： 油橄欖Olea europaea Linn.； Lr： 黑果枸杞 Lycium ruthenicum Murr.； Cn： 金花茶 Camellia nitidissima Chi； Pl： 芍藥 Paeonia lactiflora Pall.； Pg： 石榴 Punica granatum Linn.； Am： 金魚草 Antirrhinum majus Linn.； Sb： 黃芩 Scutellaria baicalensis Georgi； Lj： 忍冬 Lonicera japonica Thunb.圖3 紫丁香及其他9種植物CHI蛋白氨基酸序列的同源性比對Fig. 3 Homology comparison on amino acid sequences of CHI protein in Syringa oblata Lindl. and other nine species

2.2.3 結構及功能位點分析 對SoCHI蛋白二級結構的預測分析結果表明：在SoCHI蛋白的二級結構中，α-螺旋、延伸鏈和無規(guī)則卷曲分別包含72、46和109個氨基酸殘基，各占氨基酸殘基總數(shù)的31.7%、20.3%和48.0%。對SoCHI蛋白的三級結構進行建模(圖4)，該蛋白質(zhì)三級結構模型的QMEAN得分為0.78，且該蛋白質(zhì)的三級結構與擬南芥〔Arabidopsisthaliana(Linn.) Heynh.〕AtCHI蛋白三級結構的相似性為67.3%。

圖4 紫丁香SoCHI蛋白的三級結構Fig. 4 Tertiary structure of SoCHI protein in Syringa oblata Lindl.

對SoCHI蛋白功能位點的分析結果(圖2)表明：該蛋白質(zhì)含有2個保守的氫鍵結合位點、2個活性催化位點和7個底物結合位點，氫鍵結合位點分別位于第50位的蘇氨酸(Thr)和第108位的酪氨酸(Tyr)處；活性催化位點分別位于第115位的天冬酰胺(Asn)和第208位的Ser處，底物結合位點分別位于第38位的Arg處、第39位的Gly處、第40位的Leu處、第49位的苯丙氨酸(Phe)處、第52位的異亮氨酸(Ile)處、第111位的Lys處和第112位的纈氨酸(Val)處。這些位點均高度保守且相對位置保持不變。

2.3 SoCHI基因在紫丁香不同器官和花期的表達特性分析

2.3.1 在不同器官的表達特性分析 研究結果(圖5)表明：SoCHI基因在紫丁香的花、嫩葉、成熟葉、嫩枝和根中均有表達，但其相對表達量存在明顯差異，表現(xiàn)為在嫩葉中最高，在成熟葉中次之，在花中也較高，在嫩莖中較少，在根中極低。

F： 花 Flower； TL： 嫩葉 Tender leaf； ML： 成熟葉 Mature leaf； TS： 嫩莖 Tender stem； R： 根 Root.圖5 紫丁香不同器官中SoCHI基因的相對表達量Fig. 5 Relative expression level of SoCHI gene in differennt organs of Syringa oblata Lindl.

2.3.2 在不同花期的表達特性分析 研究結果(圖6)表明：SoCHI基因在紫丁香花芽期、花蕾期、初花期、盛花期和末花期均有表達，但其相對表達量存在明顯差異，表現(xiàn)為在花蕾期最高，在花芽期次之，在初花期和盛花期較低，在末花期最低。

FB： 花芽期 Flower bud stage； B： 花蕾期 Budding stage； EF： 初花期 Early flowering stage； FF： 盛花期 Full flowering stage； LF： 末花期 Late flowering stage.圖6 不同花期紫丁香花中SoCHI基因的相對表達量Fig. 6 Relative expression level of SoCHI gene in flower of Syringa oblata Lindl. at different flowering stages

3 討論和結論

紫丁香是中國北方地區(qū)常見的鄉(xiāng)土樹種之一，亦是國內(nèi)重要的木本花卉種類，花色和花香獨特，被廣泛用于園林綠化。本研究成功獲得紫丁香查爾酮異構酶(CHI)完整的同源基因，命名為SoCHI，該基因的開放閱讀框(ORF)長度為684 bp，編碼227個氨基酸殘基，編碼的蛋白質(zhì)為SoCHI蛋白。相關研究結果表明：CHI基因為多基因家族，且基因的結構變異較大，如油橄欖的OeCHI基因及Lotusjaponicus(Regel) K. Larsen的LjCHI1和LjCHI3基因均包含4個外顯子和3個內(nèi)含子[19-20]，大麥(HordeumvulgareLinn.)的HvCHI基因包含3個外顯子和2個內(nèi)含子[21]，蕓薹屬(BrassicaLinn.)植物的BrCHI-2、BoCHI-2和BnCHI-2基因均包含6個外顯子和5個內(nèi)含子[22]。與上述植物CHI基因不同的是，紫丁香SoCHI基因無內(nèi)含子。

蛋白質(zhì)二級結構預測結果表明：無規(guī)則卷曲在SoCHI蛋白的二級結構中所占比例最大(48.0%)，α-螺旋次之(31.7%)，延伸鏈最小(20.3%)。另外，SoCHI蛋白的氨基酸序列具有保守的氫鍵結合位點、活性催化位點和底物結合位點，與油橄欖和金花茶等植物CHI蛋白的結構相似[19，23]，屬于查爾酮合酶超家族。同源性比對結果表明：紫丁香SoCHI蛋白與薔薇科(Rosaceae)、山茶科(Theaceae)、忍冬科(Caprifoliaceae)、茄科(Solanaceae)、唇形科(Lamiaceae)及芍藥科(Paeoniaceae)植物CHI蛋白的氨基酸序列同源性略低于同科植物油橄欖和桂花的CHI蛋白，表明CHI蛋白的氨基酸序列在不同植物中相對保守。

本研究中，SoCHI基因在紫丁香嫩葉中的相對表達量最高，其次為成熟葉，這可能是紫丁香嫩葉色素積累并呈現(xiàn)紫紅色的重要原因。相關研究結果[24-26]表明：查爾酮異構酶處于植物體內(nèi)黃酮類化合物合成途徑的上游，對黃酮類化合物等次生代謝產(chǎn)物的合成具有重要作用，并且，CHI基因主要在生命活動較旺盛的器官中表達。

周興文等[23]的研究結果表明：CHI基因在植物花呈色過程中起重要作用，且植物的花色素苷含量隨該基因表達量升高而升高。在紫丁香花發(fā)育過程中，SoCHI基因的相對表達量呈先升高后降低的變化趨勢，在花發(fā)育早期特別是花蕾期最高，這一研究結果與紫丁香花蕾期花蕾顏色濃于盛花期和末花期花冠裂片顏色的現(xiàn)象相吻合。另外，CHI基因在金花茶[23]和紅掌(AthuriumandraeanumLind.)[27]等植物花發(fā)育過程中也存在類似的表達模式。根據(jù)上述研究結果推測CHI基因的表達量在不同植物花發(fā)育前期明顯升高有助于植物體內(nèi)花色素的積累。

綜上所述，SoCHI基因無內(nèi)含子，全部由外顯子構成；SoCHI蛋白屬于不穩(wěn)定蛋白和親水性蛋白，其氨基酸序列相對保守；并且，SoCHI基因的表達與紫丁香花呈色關系密切。