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血管鈣化是動脈粥樣硬化、糖尿病和高血壓等多種疾病的病理生理基礎(chǔ)[1]，出現(xiàn)在血管損傷和冠狀動脈疾病中，是動脈粥樣硬化的必然特征之一[2]，血管鈣化與生理性骨質(zhì)形成類似，是主動的、可調(diào)節(jié)的過程[3]，但具體機制尚未完全闡明。既往研究表明，許多血管活性因子參與血管鈣化的過程，本課題組前期實驗亦發(fā)現(xiàn)一些心血管活性因子參與血管鈣化的發(fā)生和發(fā)展，如尾加壓素Ⅱ、炎癥因子及醛固酮等[4 -6]，因此，新的血管活性肽對血管鈣化的機制研究及防治具有重要意義。

salusins是由28個氨基酸組成的salusin -α和20個氨基酸組成的salusin -β兩種活性單體組成。salusin -α作為一種新的血管活性肽可參與高血壓、動脈粥樣硬化[7]等多種心血管疾病的發(fā)病過程，但是否參與血管鈣化的發(fā)生和發(fā)展，目前國內(nèi)外尚無報道，本研究通過制作維生素D3與尼古丁誘導(dǎo)的大鼠血管鈣化模型上，觀察salusin -α在血漿和主動脈組織中的表達，初步探討其在血管鈣化中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及藥品 8周齡雄性SD大鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司 [動物許可證號：SCXK(京)2012 -0001]。尼古丁購自Merck公司，維生素D3購自Sigma公司，鈣離子測試盒、堿性磷酸酶(ALP)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；salusin -α試劑盒購自北京華英生物研究所。其余為進口或國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 血鈣鈣化動物模型制備 參照文獻[8]制備大鼠血管鈣化模型，取16只雄性SD大鼠，體重160 g～180 g，隨機分為鈣化組和對照組各8只。鈣化組：08:00維生素D33×105IU/kg肌肉注射， 同時尼古丁25 mg/kg溶于1 mL花生油灌胃， 18:00重復(fù)灌胃1次。對照組：類似鈣化組操作，但采用肌肉注射生理鹽水和單純花生油灌胃。兩組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)4周后，用3%水合氯醛腹腔麻醉，心臟取血，置入含有乙二胺四乙酸(EDTA)和抑肽酶的試管中，4 ℃離心分離血漿；摘取5 mm 胸主動脈，用冰生理鹽水沖洗后，部分石蠟包埋用于染色，-80 ℃儲存待測。

1.3 Von Kossa染色 將大鼠胸主動脈組織進行石蠟包埋、切片，行常規(guī)脫蠟、脫水后浸入5%硝酸銀溶液中，紫外線下照射30 min，再用2.5%硫代硫酸鈉溶液處理1 min定影，然后依次用0.25%堿性品紅復(fù)染，經(jīng)脫水、透明、封片，在光鏡下觀察。

1.4 血管組織ALP活性及鈣含量測定 將大鼠主動脈組織置于液氮中研磨，4 ℃ 3 000 r/min離心10 min，取上清以考馬斯亮藍法行蛋白定量。分別按照ALP 測定試劑盒及鈣測試盒(甲基百里香酚藍比色法)說明書測定主動脈ALP 活性及鈣含量。

1.5 salusin -α含量的測定 取血漿約200 μL及主動脈組織約50 mg(用錫紙包裹)，干冰低溫保存下送北京華英生物研究所檢測，采用放射免疫法檢測，具體按說明書進行。

2 結(jié) 果

2.1 血管鈣化大鼠模型的特征 Von Kossa染色可見主動脈中膜彈性纖維間黑色顆粒沉積，表明鈣鹽沉積。詳見圖1。

黑色顆粒為鈣鹽沉積。

圖1大鼠主動脈Von Kossa染色(×100)

2.2 大鼠主動脈組織鈣含量、ALP活性的變化 鈣化組鈣含量及ALP活性明顯高于對照組(P<0.01)。詳見表1。

表1 兩組主動脈鈣含量與ALP活性比較(±s)

2.3 大鼠血清和主動脈組織salusin -α含量的變化 鈣化組大鼠血清和主動脈組織中salusin -α的表達明顯下調(diào)(P<0.01)。詳見表2。

表2 兩組血清和主動脈組織salusin -α表達比較(±s)

3 討 論

血管鈣化是一個主動、可調(diào)節(jié)的過程，血管平滑肌細胞由收縮表型轉(zhuǎn)變?yōu)槌晒羌毎麡颖硇褪茄茆}化的基礎(chǔ)。病理情況下如氧化應(yīng)激、高血壓、高血糖、高脂血癥以及炎癥反應(yīng)等，可導(dǎo)致血管損傷，可能為血管鈣化始動因素或促進因素。近年來，調(diào)節(jié)血管功能的活性因子，尤其是心血管組織產(chǎn)生的旁/自分泌活性肽或活性因子逐漸成為研究的熱點，隨著研究的深入，與血管鈣化相關(guān)的多條信號通道包括轉(zhuǎn)化生長因子 -β(TGF -β)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)Smad通路和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路等[9 -10]也成為目前研究的焦點。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)尾加壓素Ⅱ、醛固酮和部分炎癥因子等活性因子的表達均與血管鈣化的程度呈正相關(guān)，提示其促進血管鈣化的作用與加重血管損傷或功能受損有關(guān)，且促進血管鈣化因子之間對血管鈣化的發(fā)展有協(xié)同作用。而國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)抑制血管鈣化的因子如Intermedin[11]、Fetuin -A[12]等可保護血管功能并減輕血管鈣化的程度。因此，尋找新的參與血管鈣化的活性因子對于闡明血管鈣化的機制及血管鈣化的防治具有重要意義。

salusins具有促進平滑肌細胞和成纖維細胞增殖、降低血壓并減慢心率和參與細胞內(nèi)鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的效應(yīng)，可能與動脈粥樣硬化等多種心血管疾病有關(guān)。salusin -α作為一種新的心血管活性肽可延緩動脈粥樣硬化的發(fā)病過程，有研究表明salusin -α具有舒張血管、促進細胞增殖等生物學效應(yīng)[13 -14]，Watanabe等[15]發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)的人巨噬細胞中，salusin -α可通過下調(diào)膽固醇?；D(zhuǎn)移酶1的表達，抑制泡沫細胞的形成，發(fā)揮抗動脈粥樣硬化的作用，其與salusin -β的作用可能剛好相反，而在本課題組前期實驗研究中發(fā)現(xiàn)salusin -β可促進血管鈣化。本實驗進一步探討salusin -α是否是心血管保護因子。

本研究發(fā)現(xiàn)鈣化組大鼠血漿和主動脈組織salusin -α的表達明顯比對照組減少，提示salusin -α參與了血管鈣化的發(fā)生與發(fā)展，且可能為新的血管鈣化抑制因子，這一發(fā)現(xiàn)將為血管鈣化的機制研究及防治提供新的思路。但salusin -α抑制血管鈣化的具體機制尚不十分明確，有學者認為salusin -α可能通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑保護心肌缺血損傷[16]，后續(xù)研究將針對這一問題進行深入探討。