蔡弘揚(yáng)　王晉

摘 要：目的： 觀察Wnt3a對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的影響。方法：以Aβ25-35 （30 μmol/L）誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，MTT法測(cè)定細(xì)胞的存活率，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)。結(jié)果：在PC12細(xì)胞的培養(yǎng)過(guò)程中，采用MTT法測(cè)定細(xì)胞的存活率，PC12 細(xì)胞依賴Wnt3a濃度的增加而存活率升高，在濃度100 ng/ml時(shí)達(dá)到最佳值。結(jié)論：Wnt3a對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：Wnt3a PC細(xì)胞 細(xì)胞損傷 氧化應(yīng)激

中圖分類號(hào)R285 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1003-9082（2018）07-0-02

隨著社會(huì)老齡化進(jìn)程的加快，阿爾茨海默?。ˋD）的發(fā)病率和發(fā)病人數(shù)急劇上升。傳統(tǒng)的藥物治療，如使用改善腦循環(huán)藥物、能量代謝促進(jìn)劑、乙酰膽堿酯酶抑制劑等，療效有限[1]。因而，研究AD發(fā)病機(jī)制，并針對(duì)病因進(jìn)行分子水平的治療，將成為改善阿爾茨海默病癥狀、治愈AD的新思路。

神經(jīng)損傷及凋亡是阿爾茨海默病的病理機(jī)制，氧化應(yīng)激損傷在神經(jīng)退行性病變中具有重要的病因?qū)W意義[2]。研究表明，線粒體裂變或者聚變，都可以對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷[3]，也可能產(chǎn)生局部生物能量的缺乏。目前，已有較多的證據(jù)表明，線粒體形態(tài)的異?；蚬δ艿娜毕荩瑫?huì)導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的損傷或者死亡。因而，線粒體作為細(xì)胞的一個(gè)中央細(xì)胞器是潛在治療AD的新靶點(diǎn)[4]。但是，在AD的發(fā)病機(jī)制中，是否與一些線粒體功能的缺陷而導(dǎo)致的發(fā)病存在聯(lián)系，尚不清楚[5]。

一、材料和方法

1.材料

1.1細(xì)胞大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞株P(guān)C12細(xì)胞來(lái)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞所。

1.2試劑：DMEM培養(yǎng)基（ Gibcol），胎牛血清（ 四季青），Wnt3α（Sigma）

2.方法

2.1 PC-12細(xì)胞的體外培養(yǎng) PC-12細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶，置于37℃、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。完全培養(yǎng)基為DMEM添加15%小牛血清。每3 d換液1次，3～4 d以1：5進(jìn)行傳代。

2.2 PC-12細(xì)胞的Aβ25-35誘導(dǎo)和Wnt信號(hào)通路干擾 Aβ25-35 （Sigma）100 ?mol/L，過(guò)濾并分裝后，貯存于-20℃。使用前在37℃溫箱孵育7天，并用新鮮的完全培養(yǎng)基稀釋為工作濃度10 ?mol/L、20 ?mol/L、 30 ?mol/L、40?mol/L和50 ?mol/L。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC-12細(xì)胞，消化并離心收集后，重懸在完全培養(yǎng)基中，以5×105/cm2的密度接種在培養(yǎng)瓶和六孔板表面生長(zhǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)至80%融合時(shí)，去除培養(yǎng)基，并加入新鮮培養(yǎng)基，其中含梯度濃度（10～50?mol/L）Aβ25-35，置于上述條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。加藥24 h，收集細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。為了觀察Wnt信號(hào)通路及線粒體的缺陷的影響，確定實(shí)驗(yàn)Aβ25-35 30 ?mol/L培養(yǎng)基中加入經(jīng)典Wnt通路的激活Wnt3a 50 ng/ml、100 ng/ml 和200 ng/ml，48 h以后收集細(xì)胞進(jìn)行觀察和檢測(cè)。

2.3按照處理因素對(duì)細(xì)胞分組

實(shí)驗(yàn)設(shè)4組，每組6個(gè)樣本（n=6）。各組處理如下。組1使用完全培養(yǎng)基；組2使用完全培養(yǎng)基+Aβ25-35 30 ?mol/L+ Wnt3a 50 ng/ml；組3為完全培養(yǎng)基+Aβ25-35 30?mol/L+Wnt3a 100 ng/ml；組4為完全培養(yǎng)基+Aβ25-35 30 ?mol/L+ Wnt3a 200 ng/ml。

2.4 用新鮮配制RPMI1640培養(yǎng)基把細(xì)胞配制成單個(gè)細(xì)胞懸液，在96孔培養(yǎng)板中接種，每孔5×104個(gè)細(xì)胞200?l量，并設(shè)置平行孔。2.5向?qū)嶒?yàn)組中分解加入同上分組Wnt3a的劑量，在對(duì)照組應(yīng)加入同等量的生理鹽水。加藥后經(jīng)過(guò)12h、24h、36h、48h分別作用后，每孔加入20?l的MTT溶液，不棄去培養(yǎng)基的條件下，放入37℃和5%CO2孵育箱內(nèi)孵育4小時(shí)，等待檢測(cè)。將每組每孔細(xì)胞均勻輕輕細(xì)細(xì)吹打，混勻，移入1.5mlEP管中，離心，再在每孔中加入二甲基亞砜150?l，輕輕搖蕩10min，使其完全得到溶解。然后將混合液再次置入96孔板中，將96孔板放入酶標(biāo)儀中，選擇波長(zhǎng)490nm處，檢測(cè)各孔的光吸收值，記錄結(jié)果并把結(jié)果打印。根據(jù)該結(jié)果計(jì)算增殖抑制率，抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組值/對(duì)照組值）×100%來(lái)實(shí)現(xiàn)的，根據(jù)增殖抑制率的結(jié)果得出細(xì)胞的最適作用濃度和最適作用時(shí)間。

二、結(jié)果

我們采用大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞株建立AD細(xì)胞模型。體外培養(yǎng)的PC12細(xì)胞，對(duì)實(shí)驗(yàn)中的各項(xiàng)檢測(cè)，均選取低代數(shù)（小于P5）、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)和藥物處理。

本實(shí)驗(yàn)采用順梯度濃度的Aβ25-35與 PC12 細(xì)胞共培養(yǎng)孵育24 h， Fig. 1A 所示細(xì)胞活力隨著Aβ25-35濃度的遞增而降低，結(jié)合細(xì)胞形態(tài)觀察，本實(shí)驗(yàn)選取30?mol/L作為Aβ25-35誘導(dǎo)AD細(xì)胞模型的適宜濃度，及進(jìn)行后續(xù)研究。

細(xì)胞接種 24 h 后除對(duì)照組外其余均加入30 μmol/LAβ25-35，同時(shí)除建造的AD模型組外其余加入不同濃度（ 50、100、200 ng/ml） Wnt3a 48 h， 如 Fig. 1B 所示PC12 細(xì)胞依賴Wnt3a濃度的增加而存活率升高，在濃度100 ng/ml時(shí)達(dá)到最佳值。

Fig.1

MTT法測(cè)定PC12細(xì)胞凋亡（ n = 6）. *P < 0. 05， **P< 0. 01 vs 對(duì)照組（Aβ25-35= 0）.

結(jié)合細(xì)胞形態(tài)觀察，本實(shí)驗(yàn)選取30?mol/L作為Aβ25-35誘導(dǎo)AD細(xì)胞模型的適宜濃度。在此實(shí)驗(yàn)中，建立AD模型的PC12 細(xì)胞通常在接種24 h時(shí)開始接受處理，即：去除原培養(yǎng)基，更換為含Aβ25-35（30 mol/L）的新鮮培養(yǎng)基，持續(xù)作用24 h，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別加50 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml Wnt3a持續(xù)到48 h。觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)情況如圖（Fig.2）。

A AD模型 B AD+wnt3a（50ng/ml） C AD+wnt3a（100ng/ml） D AD+wnt3a（200ng/ml）

Fig.2：PC12在倒置顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)

三、討論

阿爾茨海默?。ˋD）是一種進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病，臨床表現(xiàn)包括進(jìn)行性記憶減退，認(rèn)知功能障礙等，并伴有機(jī)體內(nèi)大量的大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的丟失。機(jī)體在新陳代謝過(guò)程中持續(xù)生成各種類型的氧自由基代謝產(chǎn)物，并且通過(guò)各種抗氧化酶將自由基進(jìn)行清除，包括超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶等。此外，各種環(huán)境污染物、紫外線照射等也是氧自由基的重要來(lái)源[6]。機(jī)體的氧化損傷即機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的氧自由基得不到及時(shí)清除，導(dǎo)致活性氧在體內(nèi)堆積引起細(xì)胞毒性，是機(jī)體各組織老化的重要誘因。AD 病人體內(nèi)自由基生成增加，尤其是腦組織中神經(jīng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激是導(dǎo)致其腦結(jié)構(gòu)和功能改變的原因之一[7]。

基于上述討論，我們推測(cè)AD發(fā)病中，線粒體的缺失或者異常導(dǎo)致細(xì)胞的氧化損傷，以至于導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡。通過(guò)影響Wnt信號(hào)通路，改變Aβ對(duì)細(xì)胞的毒性作用，以減少對(duì)細(xì)胞的氧化損傷。其中，Wnt信號(hào)通路中的wnt3a蛋白發(fā)揮著主要作用。

Aβ是AD發(fā)病的始動(dòng)因素，長(zhǎng)期以來(lái)也是AD治療的重要靶標(biāo)。一方面Aβ能夠影響細(xì)胞骨架的完整性。另一方面，Aβ的細(xì)胞毒性作用可能干擾線粒體的功能障礙，β-淀粉樣蛋白積聚而成的毒性肽鏈與過(guò)氧化氫酶相互作用，令過(guò)氧化氫酶喪失正常功能，導(dǎo)致培養(yǎng)基內(nèi)的神經(jīng)細(xì)胞受到氧化損傷如圖（Fig.1 、Fig.2）。

本實(shí)驗(yàn)利用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖活力間接測(cè)線粒體酶的活力反映細(xì)胞活力， 結(jié)果表明濃度超過(guò)20?mol/L Aβ25-35與 PC12 細(xì)胞孵育 24 h 能明顯抑制WST-1代謝率，說(shuō)明Aβ25-35釋放毒性對(duì)細(xì)胞線粒體功能造成障礙；Wnt3a能濃度依賴性改善WST-1代謝率，在Wnt3a100ng/ml達(dá)到最佳值， 表明Wnt3a對(duì)Aβ25-35釋放毒性造成的線粒體損傷具有保護(hù)作用（Fig.1），形態(tài)學(xué)觀察表明30?mol/L Aβ25-35與 PC12 細(xì)胞孵育24 h 細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變有菱形變成了扁形，表明細(xì)胞發(fā)生損傷； Wnt3a在50 ng/ml和100 ng/ml細(xì)胞的形態(tài)明顯得到了改善，表明Wnt3a能增加存活細(xì)胞數(shù)目如圖（Fig.2）。

氧化應(yīng)激理論認(rèn)為，由細(xì)胞內(nèi)的線粒體經(jīng)呼吸作用產(chǎn)生的天然副產(chǎn)物——不斷積累的有害性活性氧自由基（ROS）不但可損害各種分子（包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)與核酸），而且還會(huì)隨著時(shí)間的積累對(duì)細(xì)胞功能產(chǎn)生有害影響[8]。近期研究表明，有一條路徑機(jī)制與淀粉樣蛋白無(wú)關(guān)?！皦牡摹盇poE4會(huì)分解形成有毒的碎片，這些碎片會(huì)搗毀細(xì)胞的能量工廠—線粒體—從而改變細(xì)胞構(gòu)架。

雖然究竟什么才是最終引起細(xì)胞凋亡及死亡的特異性生物化學(xué)事件依然存在爭(zhēng)議，但是我們已經(jīng)知道的是，在細(xì)胞培養(yǎng)中，如果找到存在的適當(dāng)濃度的“矯正”分子，就會(huì)減少線粒體的損害以及神經(jīng)元紊亂的發(fā)生。目前，研究者正在動(dòng)物模型中對(duì)這些分子進(jìn)行更加嚴(yán)格的檢測(cè)。如果最終證明這些分子在人體內(nèi)是安全和有效的，那么我們就終于看到了曙光。

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