米紅梅，張娜，劉寧

二甲苯（xylene）是一種揮發(fā)性液體，隨著工業(yè)發(fā)展，二甲苯用途越來(lái)越廣泛，但近年來(lái)因意外或長(zhǎng)期接觸二甲苯導(dǎo)致中毒的病例也日益增多[1?2]，筆者亦曾報(bào)道1例慢性二甲苯中毒導(dǎo)致重度肝損傷的病例[3]。以往研究多是通過(guò)形態(tài)學(xué)改變研究二甲苯中毒導(dǎo)致的器官損傷[4]，其分子生物學(xué)水平的研究報(bào)道較少，其導(dǎo)致肝功能損傷的確切機(jī)制尚不明確，目前臨床尚無(wú)針對(duì)其治療的特效藥物。有研究發(fā)現(xiàn)銀杏葉提取物（ginkgo biloba extract，GBE）對(duì)酒精性脂肪性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎等均具有一定保護(hù)作用[5?6]，但其對(duì)二甲苯中毒所致的肝損傷是否具有保護(hù)作用尚不明確。本研究通過(guò)建立小鼠二甲苯中毒肝損傷模型，采用GBE進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn)，探討其對(duì)二甲苯中毒小鼠肝損傷的干預(yù)效果和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級(jí)健康昆明種小鼠30只，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)。銀杏葉提取物注射液（悅康藥業(yè)集團(tuán)有限公司17.5 mg/5 mL）；氣相色譜儀（山東瑞普分析儀器有限公司）；二甲苯（天津市永大化學(xué)試劑有限公司）；X線片、顯影液、定影液（廈門銳珂醫(yī)療器材有限公司）；鼠抗鼠β?actin單克隆抗體、兔抗鼠腫瘤壞死因子α（TNF?α）多克隆抗體、兔抗鼠核轉(zhuǎn)錄因子?κB（NF?κB）多克隆抗體（上海生工生物工程公司）；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及染毒模型制備 按照隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分為正常對(duì)照組（Control組）、模型組（Model組）、銀杏葉提取物干預(yù)組（GBE組），每組10只。3組均自由進(jìn)食，Model組和GBE組均通過(guò)吸入濃度為110～130 mg/m3（采集箱內(nèi)空氣樣本，用氣相色譜直接進(jìn)樣法測(cè)得）氣體二甲苯制備二甲苯中毒肝損傷模型[4]，Control組小鼠吸入空氣。GBE組腹腔注射50 mg/（kg·d）[6]的銀杏葉提取物注射液，因腹腔注射操作不當(dāng)死亡1只；Control組和Model組均腹腔注射等量生理鹽水，2組小鼠全部存活。喂養(yǎng)8周后，實(shí)驗(yàn)小鼠禁食12 h，在深度麻醉下摘眼球取血，4℃離心分離血清。部分肝組織以4%中性甲醛固定，備做病理切片，其余肝組織用液氮快速冷凍、置于?80℃冰箱保存，備提取RNA、蛋白。

1.2.2 血清生化指標(biāo)檢測(cè) 應(yīng)用日本Olympus AU 5400全自動(dòng)生化分析儀酶法測(cè)定各組血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、總膽紅素（TBIL）、堿性磷酸酶（ALP）、γ?谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（GGT）水平。

1.2.3 肝組織病理學(xué)觀察 4%中性甲醛固定后的標(biāo)本依次進(jìn)行梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，5 μm連續(xù)切片，進(jìn)行常規(guī)蘇木精?伊紅（haematoxylin and eosin，HE）染色。光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織病理改變。

1.2.4 采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT?PCR）檢測(cè)肝組織NF?κB和TNF?α mRNA表達(dá) 各基因引物序列由上海生工生物工程公司設(shè)計(jì)并合成，引物序列見表1。Trizol試劑一步法提取肝組織總RNA，以寡脫氧核苷酸和M?MLV逆轉(zhuǎn)錄酶制備cDNA。用TaqDNA多聚酶擴(kuò)增cDNA產(chǎn)物，各基因的擴(kuò)增反應(yīng)條件為：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。以2%瓊脂糖電泳分離擴(kuò)增產(chǎn)物，溴化乙啶染色后以Bio?profif凝膠圖像分析儀進(jìn)行圖像采集，以3?磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde?3?phosphate dehydroge?nase，GAPDH）為內(nèi)參照。采用Quantity one分析軟件進(jìn)行半定量分析，結(jié)果以各基因和內(nèi)參的灰度比值表示。

Tab.1 NF-κB,TNF-α and GAPDH primer sequences表1 NF-κB、TNF-α及GAPDH引物序列

1.2.5 Western blot檢測(cè)肝組織NF?κB和TNF?α表達(dá) 以含蛋白酶抑制劑的組織裂解液提取肝組織蛋白，紫外分光光度計(jì)（280 nm）測(cè)定蛋白濃度。在室溫條件下電泳，起始電壓80 V，待蛋白溶液通過(guò)濃縮膠后將電壓改為120 V繼續(xù)電泳，待溴酚藍(lán)到達(dá)距分離膠下緣上1 cm時(shí)，停止電泳。取下凝膠，在半干轉(zhuǎn)印槽中0.8 mA/cm2恒流狀態(tài)下進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，根據(jù)蛋白的分子質(zhì)量確定轉(zhuǎn)膜時(shí)間。封閉后，分別與鼠抗鼠β?actin單克隆抗體（1∶500）、兔抗鼠TNF?α多克隆抗體（1∶200）、兔抗鼠NF?κB多克隆抗體（1∶200）反應(yīng)，4℃過(guò)夜后與相應(yīng)的二抗進(jìn)行免疫反應(yīng)，化學(xué)發(fā)光顯色，膠片曝光顯影。以β?actin為內(nèi)參照。采用Quantity one分析系統(tǒng)軟件對(duì)Western blot結(jié)果進(jìn)行半定量分析，結(jié)果以目的蛋白與β?actin的積分吸光度比值表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行SNK?q法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血清生化指標(biāo)比較 與Control組比較，Model組 ALT、AST、TBIL、ALP、GGT明顯升高（均P＜0.05）；與Model組比較，GBE組ALT、AST、TBIL均明顯降低（均P＜0.05），ALP、GGT與Model組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表2。

2.2 肝組織病理光鏡下觀察 Control組小鼠肝組織未見明顯異常。Model組小鼠肝組織可見肝細(xì)胞腫大，部分肝細(xì)胞呈脂肪樣變性，局部可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及點(diǎn)灶狀肝細(xì)胞壞死灶。與Model組比較，GBE組肝組織炎癥程度減輕。見圖1。

Tab.2 Comparison of serum biochemical indexes between three groups表2 各組小鼠血清生化指標(biāo)比較 （±s）

Tab.2 Comparison of serum biochemical indexes between three groups表2 各組小鼠血清生化指標(biāo)比較 （±s）

＊P＜0.05；a與Control組比較，b與Model組比較，P＜0.05

組別Control組Model組GBE組F n 10 10 9 ALT（U/L）31.20±7.19 276.00±46.57a 77.00±12.47ab 205.75＊AST（U/L）33.20±3.63 267.20±52.56a 72.22±12.97b 153.70＊TBIL（μmol/L）13.40±3.25 35.92±6.83a 26.88±7.04ab 36.59＊ALP（U/L）81.60±20.82 220.20±66.06a 180.44±28.47a 26.56＊GGT（U/L）32.34±10.06 110.74±37.10a 88.24±15.52a 27.71＊

Fig.1 HE staining of liver tissue sections of three groups of mice(×200)圖1 各組小鼠肝組織病理學(xué)改變（HE染色，×200）

2.3 各組肝組織NF?κB和TNF?α mRNA表達(dá)水平比較 與Control組比較，Model組TNF?α、NF?κB mRNA表達(dá)水平明顯升高（均P＜0.05）；與Model組比較，GBE組TNF?α、NF?κB mRNA表達(dá)水平降低（均P＜0.05）。見圖2、3，表3。

Fig.2 The mRNA expression of TNF?α in liver(RT?PCR)圖2 各組小鼠肝組織TNF?α mRNA表達(dá)（RT?PCR）

Fig.3 The mRNA expressions of NF?κB of liver(RT?PCR)in three groups圖3 各組小鼠肝組織NF?κB mRNA表達(dá)（RT?PCR）

2.4 各組肝組織NF?κB和TNF?α蛋白表達(dá)水平比較 與Control組比較，Model組TNF?α、NF?κB蛋白表達(dá)水平明顯升高（均P＜0.05）。與Model組比較，GBE組NF?κB、TNF?α蛋白表達(dá)水平降低（均P＜0.05）。見圖4、5，表4。

Tab.3 Expressions of NF-κB and TNF-α mRNA in livertissue of mice表3 各組小鼠肝組織NF-κB、TNF-α mRNA表達(dá)（±s）

Tab.3 Expressions of NF-κB and TNF-α mRNA in livertissue of mice表3 各組小鼠肝組織NF-κB、TNF-α mRNA表達(dá)（±s）

＊P＜0.05；a與Control組比較，b與Model組比較，P＜0.05

組別Control組Model組GBE組F n 10 10 9 TNF?α 0.59±0.04 1.35±0.11a 1.09±0.08ab 217.36＊NF?κB 0.60±0.07 1.42±0.09a 1.02±0.05ab 288.84＊

Fig.4 The protein expression of TNF?α in liver tissue of mice圖4 各組小鼠肝組織TNF?α蛋白表達(dá)

3 討論

二甲苯是具有芳香氣味的揮發(fā)性液體，主要經(jīng)呼吸道、皮膚、消化道等吸收進(jìn)入機(jī)體，對(duì)機(jī)體組織器官造成損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，在二甲苯誘導(dǎo)的肝損傷模型中，小鼠短時(shí)間內(nèi)接觸高劑量二甲苯可導(dǎo)致肝細(xì)胞水腫，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及肝細(xì)胞壞死灶形成；血清ALT、AST、TBIL、ALP、GGT明顯升高，提示造模成功，短期內(nèi)接觸大量二甲苯可以導(dǎo)致肝組織損傷。銀杏葉提取物干預(yù)組肝臟炎癥較模型組明顯減輕，血清ALT、AST、TBIL降低，提示銀杏葉提取物可以減輕二甲苯誘導(dǎo)的肝臟炎癥反應(yīng)。

Fig.5 The protein expression of NF?κB in liver tissue of mice圖5 各組小鼠肝組織NF?κB蛋白表達(dá)

Tab.4 Expressions of NF-κB and TNF-α protein in liver tissue of mice表4 各組小鼠肝組織NF-κB、TNF-α蛋白表達(dá)（±s）

Tab.4 Expressions of NF-κB and TNF-α protein in liver tissue of mice表4 各組小鼠肝組織NF-κB、TNF-α蛋白表達(dá)（±s）

＊P＜0.05；a與Control組比較，b與Model組比較，P＜0.05

組別Control組Model組GBE組F n 10 10 9 TNF?α 0.71±0.08 1.25±0.12a 0.92±0.06ab 86.29＊NF?κB 0.65±0.04 1.30±0.14a 0.84±0.05ab 148.36＊

NF?κB是一種調(diào)控炎癥基因轉(zhuǎn)錄的核因子，在炎癥反應(yīng)中起著重要的作用。生理情況下呈非活性狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞受到刺激后NF?κB活化，活化的NF?κB可調(diào)控TNF?α、白細(xì)胞介素、黏附分子等炎癥因子的表達(dá)[7?8]，參與炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，在二甲苯誘導(dǎo)的肝損傷模型中，伴隨肝臟炎癥的發(fā)生，模型組肝組織NF?κB、TNF?α mRNA和蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，肝臟炎癥程度與NF?κB、TNF?α mRNA和蛋白表達(dá)趨勢(shì)一致，推測(cè)其可能的機(jī)制為：二甲苯刺激肝細(xì)胞后導(dǎo)致NF?κB活化，活化后的NF?κB作為上游細(xì)胞因子調(diào)控下游TNF?α的合成和釋放，從而導(dǎo)致肝細(xì)胞炎癥發(fā)生。另外TNF?α作為細(xì)胞外刺激因子，與其受體結(jié)合后在蛋白激酶C的輔助下，激活NF?κB，進(jìn)一步放大炎癥反應(yīng)，形成惡性循環(huán)。

銀杏葉提取物具有抗炎、抗氧化、改善循環(huán)等多種藥理學(xué)作用，其主要化學(xué)成分為黃酮類、萜內(nèi)酯類等。本研究發(fā)現(xiàn)，銀杏葉提取物干預(yù)組血清ALT、AST、TBIL較模型組明顯降低，與張曉蘋等[9]研究結(jié)果一致，提示銀杏葉提取物可以減少肝細(xì)胞水腫、壞死，減輕肝細(xì)胞炎癥反應(yīng)。本研究中銀杏葉提取物干預(yù)組血清ALP、GGT與模型組無(wú)明顯差異；張曉蘋等[9]應(yīng)用銀杏葉提取物對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果示ALP較模型組明顯下降，兩實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致。而高曉倩等[10]研究不同劑量銀杏葉提取物對(duì)ALP的影響，發(fā)現(xiàn)50 mg/（kg·d）劑量組ALP與模型組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)合本研究及既往研究結(jié)果，推測(cè)其原因可能為本實(shí)驗(yàn)銀杏葉提取物用量小導(dǎo)致治療效果欠佳有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，銀杏葉提取物干預(yù)組NF?κB、TNF?α mRNA和蛋白均較模型組降低，其變化趨勢(shì)與ALT、AST變化趨勢(shì)一致，推測(cè)銀杏葉提取物可能是通過(guò)抑制NF?κB、TNF?α炎癥因子的表達(dá)，從而顯著改善二甲苯誘導(dǎo)的肝臟炎癥反應(yīng)。白紀(jì)紅等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在非酒精性脂肪性肝炎模型中，銀杏葉提取物可通過(guò)降低NF?κB、TNF?α mRNA和蛋白表達(dá)水平，從而減輕肝細(xì)胞損傷，表現(xiàn)其抗炎活性，與本研究結(jié)果一致。

綜上所述，銀杏葉提取物可以減輕二甲苯誘導(dǎo)的肝臟炎癥反應(yīng)，其機(jī)制可能與抑制NF?κB、TNF?α基因表達(dá)有關(guān)。