高福林 臧沛溪 胡小娟 張毅

作者單位：730000 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)(高福林)；730000 甘肅省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科〔高福林(在讀研究生)、臧沛溪、胡小娟、張毅〕

近年來，腦血管疾病的發(fā)病率逐年增加，其導(dǎo)致的認(rèn)知功能下降給社會(huì)帶來很多負(fù)擔(dān)。因此，關(guān)于大腦功能健康和高血壓之間關(guān)系的研究越來越受到重視[1-2]。越來越多的證據(jù)表明，高血壓是認(rèn)知功能障礙和癡呆病程中重要的危險(xiǎn)因素之一，也是最重要的可干預(yù)因素。高血壓對(duì)神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生損傷的機(jī)制尚不完全明確，目前多認(rèn)為是通過激活炎性反應(yīng)和釋放血管活性物質(zhì)等使神經(jīng)細(xì)胞受到細(xì)胞毒性分子的損害，導(dǎo)致神經(jīng)元丟失、腦白質(zhì)損傷，從而導(dǎo)致認(rèn)知功能衰退[3]。作為Toll樣受體(TLR)家族中最為被廣泛研究的TLR4，其在炎性反應(yīng)中的確切作用及其作用機(jī)制仍然是一個(gè)有爭(zhēng)議的話題[4]。有研究表明，TLR4能夠識(shí)別入侵的病原體，誘導(dǎo)一系列炎性反應(yīng)產(chǎn)生炎性因子，參與神經(jīng)炎性反應(yīng)的調(diào)控[5]。自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)作為遺傳性高血壓實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ团c人體形式的高血壓相似，其可發(fā)展成慢性嚴(yán)重高血壓，隨后出現(xiàn)腦血管病變和腦血流減少[6-7]。本研究采用SHR模型探討高血壓導(dǎo)致的認(rèn)知功能損傷與海馬區(qū)TLR4表達(dá)的變化，進(jìn)而探討高血壓引起認(rèn)知功能下降的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1動(dòng)物和主要試劑12周齡成年雄性SHR大鼠15只、成年雄性WKY大鼠6只，體重240～300 g(購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)。主要試劑包括TLR4小鼠單克隆抗體(購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司)、小膠質(zhì)細(xì)胞蛋白抗體(Iba1)兔單克隆抗體(購(gòu)自美國(guó)Abcam公司)、星形膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)兔單克隆抗體和神經(jīng)元核抗原(NeuN)兔單克隆抗體(均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司)，其余均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2方法

1.2.1鼠尾血壓監(jiān)測(cè)：隨機(jī)取SHR大鼠7只、WKY大鼠4只作為監(jiān)測(cè)對(duì)象，12周齡時(shí)監(jiān)測(cè)尾靜脈壓。于早上10點(diǎn)測(cè)量，固定大鼠，鼠尾局部加溫，待其安靜進(jìn)行血壓測(cè)量，將加壓尾套、脈搏換能器依次套在鼠尾合適位置，采用自動(dòng)測(cè)壓儀進(jìn)行測(cè)量，讀取收縮壓。連續(xù)測(cè)量3～5次，選取其中3組相對(duì)穩(wěn)定的收縮壓取其平均值作為測(cè)量值，此后于18、24、30周齡固定時(shí)間點(diǎn)監(jiān)測(cè)血壓。

1.2.2Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)：Morris水迷宮檢測(cè)系統(tǒng)由一個(gè)圓柱形水池和圖像采集分析系統(tǒng)兩部分組成。隨機(jī)取SHR大鼠7只、WKY大鼠5只作為訓(xùn)練對(duì)象，訓(xùn)練開始，將大鼠放入水池中使其熟悉迷宮環(huán)境，而后將平臺(tái)置于第二象限，將受試大鼠按順時(shí)針方向依次由第一、二、三、四象限入水點(diǎn)順序放入水中，訓(xùn)練完成臺(tái)上休息15 s再進(jìn)行下一輪實(shí)驗(yàn)。連續(xù)訓(xùn)練5天，每天以大鼠4次訓(xùn)練潛伏期的平均值作為大鼠當(dāng)天的學(xué)習(xí)成績(jī)，比較兩組大鼠每天訓(xùn)練潛伏期的差異。在隨后的18、24、30周定期監(jiān)測(cè)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，以測(cè)得不同時(shí)間點(diǎn)逃避潛伏期作統(tǒng)計(jì)分析來判斷兩組大鼠學(xué)習(xí)記憶損害程度。

1.2.3Western blot法檢測(cè)海馬區(qū)TLR4蛋白表達(dá)：35周齡時(shí)隨機(jī)取7只SHR和3只WKY大鼠，以7%(質(zhì)量濃度)水合氯醛按體質(zhì)量0.5 mL/100 g進(jìn)行腹腔麻醉，斷頭取海馬組織，配制裂解液并與海馬組織混合，將海馬組織剪碎、勻漿、超聲、震蕩、離心，取上清液，測(cè)定蛋白濃度，水煮蛋白、總蛋白上樣量為100 μg，用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離，印跡到PVDF膜。用5%(質(zhì)量濃度)脫脂牛奶封閉1 h，后加小鼠抗TLR4(1∶200)4℃過夜。TBST洗3次，加山羊抗小鼠二抗室溫孵育1 h，加顯影液顯影。分析每個(gè)特異條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算各組目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，取平均值。

1.2.4免疫組化檢測(cè)海馬區(qū)TLR4陽性細(xì)胞數(shù)：35周齡時(shí)取剩余8只SHR和3只WKY大鼠，以7%(質(zhì)量濃度)水合氯醛按體重0.5 mL/100 g進(jìn)行腹腔麻醉，心臟灌注，斷頭取腦，4%(質(zhì)量濃度)甲醛固定大腦后儲(chǔ)存于4%PA和10%(質(zhì)量濃度)蔗糖混合物中，直到腦組織沉底，再儲(chǔ)存于30%(質(zhì)量濃度)蔗糖，直到腦組織沉底。使用低溫恒溫切片機(jī)將腦組織連續(xù)切片(厚20 μm)，每隔5片取一腦片，0.01 mol/L PBS洗3次，抗原修復(fù)，0.3%(體積分?jǐn)?shù))H2O2孵育30 min。洗片，10%(質(zhì)量濃度)山羊血清封閉1 h，后加小鼠抗TLR4(1∶100)4℃過夜。洗片，加山羊抗小鼠二抗在37℃下孵育1 h。洗片。與辣根酶標(biāo)記鏈霉卵工作液在37℃下孵育1 h。洗片，0.1 mol/L Tris-Hcl洗片。DBA染色，烤片，脫色，樹膠封片，顯微鏡采集圖片，計(jì)數(shù)各組大鼠海馬DG區(qū)多個(gè)不同層面400倍鏡下TLR4陽性細(xì)胞數(shù)。

1.2.5免疫熒光技術(shù)檢測(cè)海馬區(qū)TLR4、Iba1、NeuN、GFAP陽性細(xì)胞數(shù)：取按“1.2.4”方法制備的大鼠腦組織切片，每隔5片取一腦片，以0.01 mol/L PBS洗片3次。0.3% (質(zhì)量濃度)Triton-100細(xì)胞核膜打孔，洗片。10%(質(zhì)量濃度)山羊血清封閉1 h后加小鼠抗TLR4(1∶100)或兔抗Iba1(1∶200)或兔抗GFAP(1∶200)或兔抗NeuN(1∶200)4℃過夜。洗片，加與一抗對(duì)應(yīng)的山羊抗小鼠或山羊抗兔二抗37℃避光孵育1 h。洗片，加DAPI(1∶5000)避光孵育15 min。洗片，樹膠封片，熒光顯微鏡采集圖片，計(jì)數(shù)各組大鼠海馬DG區(qū)多個(gè)不同層面200倍鏡下TLR4、Iba1、NeuN、GFAP陽性細(xì)胞數(shù)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較采用重復(fù)測(cè)量的ANOVA分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1鼠尾監(jiān)測(cè)血壓和水迷宮實(shí)驗(yàn)(1)尾靜脈血壓：與WYK大鼠相比較，SHR大鼠在各時(shí)間點(diǎn)收縮壓升高(均P<0.01)，此后收縮壓一直處于高水平狀態(tài)。兩組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)比較收縮壓差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(FSHR=0.286，P=0.835；FWYK=0.386，P=0.766)。結(jié)果見圖1。(2)水迷宮實(shí)驗(yàn)：12周齡SHR大鼠與WKY大鼠相比學(xué)習(xí)記憶能力無明顯差異(均P>0.05)。隨著周齡的增加，SHR大鼠逐漸出現(xiàn)記憶能力損害(FSHR=9.675，P<0.01)，而WKY大鼠在不同時(shí)間點(diǎn)的逃避潛伏期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(FWKY=4.308，P=0.054)。30周齡時(shí)，SHR大鼠相比WKY大鼠逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)(t=4.748，P<0.01)。結(jié)果見圖2和表1。

注：SHR：自發(fā)性高血壓大鼠，圖2～6同；與WKY大鼠比較，aP<0.01 圖 1 各組大鼠不同周齡血壓變化趨勢(shì)

2.2各組大鼠海馬區(qū)TLR4表達(dá)(1)Western

注：與組內(nèi)18周齡比較，aP<0.01；與WKY大鼠比較，bP<0.01 圖 2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力變化

blot檢測(cè)：與WKY大鼠相比，35周齡SHR大鼠海馬區(qū)TLR4蛋白表達(dá)相對(duì)增多(0.894±0.131vs.0.431±0.089；t=5.842，P<0.01)。(2)免疫組化：35周齡SHR大鼠海馬DG區(qū)TLR4陽性細(xì)胞數(shù)表達(dá)升高〔(48.5±14.364)個(gè)/400倍鏡vs.(24.5±13.077)個(gè)/400倍鏡；t=4.722，P<0.05〕。結(jié)果見圖3～4。

2.3免疫熒光技術(shù)檢測(cè)海馬區(qū)TLR4、Iba1、NeuN、GFAP表達(dá)與WKY大鼠比較，35周齡SHR海馬DG區(qū)TLR4(t=8.864，P<0.001)、Iba1(t=7.854，P<0.001)、NeuN(t=8.451，P<0.001)、GFAP(t=2.804，P=0.019)表達(dá)明顯增加，提示海馬區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞活化、神經(jīng)元核抗原被激活、星型膠質(zhì)細(xì)胞活化。結(jié)果見圖5、6。

表1 12周齡各組大鼠學(xué)習(xí)能力逃避潛伏期比較 (±s，s)

注：TLR4：Toll樣受體4，圖4～6同 圖 3 各組大鼠海馬組織TLR4蛋白表達(dá)水平(Western blot)

注：A：SHR大鼠；B：WKY大鼠 圖 4 各組大鼠海馬DG區(qū)TLR4陽性細(xì)胞數(shù)(免疫組化，比例尺=20 μm)

注：Iba1：小膠質(zhì)細(xì)胞蛋白抗體；NeuN：神經(jīng)元核抗原；GFAP：星型膠質(zhì)纖維酸性蛋白；圖6同 圖 5 免疫熒光技術(shù)檢測(cè)各組大鼠海馬TLR4(A)、Iba1(B)、NeuN(C)及GFAP(D)陽性細(xì)胞數(shù)(比例尺=50 μm)

注：aP<0.05，bP<0.01 圖 6 免疫熒光技術(shù)檢測(cè)各組大鼠海馬DG區(qū)TLR4、Iba1、NeuN及GFAP表達(dá)

3 討論

很多研究結(jié)果表明，高血壓不僅加速了顱內(nèi)外供血?jiǎng)用}的粥樣硬化，還可誘導(dǎo)血管壁膠原蛋白和纖維連接蛋白的沉積以及彈性蛋白分裂，導(dǎo)致大腦動(dòng)脈硬度增加，引起供應(yīng)大腦皮層及基底節(jié)區(qū)的小動(dòng)脈及微動(dòng)脈發(fā)生典型改變，從而導(dǎo)致腦血管病。在動(dòng)物模型中大腦微血管的損傷是大動(dòng)脈硬化和脈壓增加共同作用的結(jié)果，高血壓會(huì)加速小血管壁的重塑，從而導(dǎo)致血管功能損傷[8]。臨床試驗(yàn)中血壓增高會(huì)減弱由神經(jīng)活動(dòng)引起的腦血流量增加，導(dǎo)致腦血流量減少。這種能量供給需求與血流之間的不匹配以及基礎(chǔ)腦血流量減少被認(rèn)為是造成高血壓引起認(rèn)知功能下降的重要原因[9]。海馬在學(xué)習(xí)記憶過程當(dāng)中起著極其重要的作用，海馬受損近期記憶出現(xiàn)損傷。本研究水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)SHR大鼠隨著年齡增長(zhǎng)會(huì)出現(xiàn)不同程度的認(rèn)識(shí)損害，提示長(zhǎng)期高血壓可能引起腦血管損傷和腦血流減少，進(jìn)而導(dǎo)致海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞損傷和認(rèn)知下降。

炎性反應(yīng)在腦缺血的病理機(jī)制中扮演重要角色，并且在腦缺血和再灌注損傷的進(jìn)展中起重要作用[10]。TLR4是固有免疫系統(tǒng)啟動(dòng)的重要組成部分，在鼠類動(dòng)物腦組織神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá)[11]，它不僅介導(dǎo)固有免疫反應(yīng)，還參與了炎性反應(yīng)和神經(jīng)退行性病變[12-13]。在TLR4信號(hào)介導(dǎo)途徑中，活化的TLR4使下游激酶p-IKKα/β磷酸化，繼而誘導(dǎo)p-IκBα磷酸化，引起核因子-κB(NF-κB)的核易位導(dǎo)致細(xì)胞因子和趨化因子合成釋放[14]。研究發(fā)現(xiàn)，TLR4表達(dá)增多加劇了海馬區(qū)相關(guān)炎性細(xì)胞因子水平的增加，可能進(jìn)一步通過激活小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞等激發(fā)神經(jīng)炎性反應(yīng)，最終導(dǎo)致神經(jīng)元損傷認(rèn)知下降。本研究結(jié)果顯示，SHR大鼠海馬區(qū)TLR4表達(dá)較WKY明顯升高，且Iba1、GFAP、NeuN的表達(dá)亦升高，提示長(zhǎng)期慢性炎性損傷可以引起海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞損傷，包括膠質(zhì)細(xì)胞活化、NeuN激活，SHR大鼠認(rèn)知功能的下降一部分可能歸因于TLR4的過度表達(dá)。這點(diǎn)在國(guó)外文獻(xiàn)[15]中亦有提到。因此，作者推測(cè)TLR4作為固有免疫炎性反應(yīng)介導(dǎo)因子可能介導(dǎo)炎性反應(yīng)因子過度釋放引起神經(jīng)細(xì)胞損傷，長(zhǎng)期過度的損傷導(dǎo)致認(rèn)知功能下降。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示SHR大鼠認(rèn)知功能下降，其海馬區(qū)TLR4、Iba1、GFAP及NeuN表達(dá)較WKY大鼠升高，推測(cè)高血壓在大鼠認(rèn)知功能損傷的過程中起重要作用。長(zhǎng)期慢性高血壓一方面引起固有免疫系統(tǒng)反應(yīng)，另一方面刺激炎性反應(yīng)因子過度表達(dá)，從而對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞產(chǎn)生損傷，兩者共同作用導(dǎo)致神經(jīng)功能受損，最終引起認(rèn)知功能損害。TLR4作為固有免疫炎性反應(yīng)介導(dǎo)因子，在細(xì)胞損傷過程發(fā)揮重要作用，通過阻斷TLR4信號(hào)可能延緩細(xì)胞炎性損傷的過程。