宋春蕾 趙剛 王明明 宋佳

【摘要】 目的：觀察牙周炎大鼠牙移動(dòng)保持期間，采取灌胃補(bǔ)骨脂水煎液對(duì)牙周組織中OPG表達(dá)情況。方法：按照隨機(jī)數(shù)字表法將45只建立牙周炎的雄性大鼠分為三組，每組15只?？瞻讓?duì)照組：建立牙移動(dòng)模型后處死。實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組：牙移動(dòng)模型建立后去除拉簧，安放保持裝置，各保持3、7、14、21 d。實(shí)驗(yàn)組在保持期內(nèi)灌胃補(bǔ)骨脂水煎液，陰性對(duì)照組灌服等量生理鹽水。制作免疫組化切片，觀察上頜第一磨牙遠(yuǎn)中側(cè)牙周組織OPG的表達(dá)情況。結(jié)果：陰性對(duì)照組在早期變化不顯著，3 d后不斷增加，實(shí)驗(yàn)組在整個(gè)保持階段OPG的表達(dá)呈不斷增加的趨勢(shì)。在同一時(shí)段進(jìn)行對(duì)比，實(shí)驗(yàn)組OPG的表達(dá)均明顯大于陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：補(bǔ)骨脂水煎液可提高牙周炎大鼠牙移動(dòng)后牙周OPG的表達(dá)，加快牙周改建。

【關(guān)鍵詞】 補(bǔ)骨脂； 牙周炎； 牙移動(dòng)； 保持； OPG

【Abstract】 Objective：To observe the expression of OPG in periodontal tissues during the retention period after tooth movement in the rats with periodontitis.Method：According to random number table method，45 male rats with established periodontitis were divided into 3 groups，15 rats in each group.The blank control group：rats were sacrificed after the establishment of tooth movement model.The experimental group and the negative control group：after the establishment of tooth movement model，the reed spring was removed，the retainer were maintained 3，7，14，21 days.The experimental group was orally administered with Psoralen Water Decoction during the retention period，the negative control group was given the same amount of Normal Saline.Immunohistochemical section was made to observe the expression of OPG in the distal periodontal tissue of maxillary first molar.Result：In the negative control group，the change was not significantly at the early stage and increased continuously after 3 days，the expression of OPG increased continuously in the experimental group showed an increasing trend during the whole retention period.The OPG expression at all time points of the experimental groups were significantly higher than that in the negative control group（P<0.05）.Conclusion： Psoralea Water Decoction can improve the expression of OPG in periodontal tissue of rats with periodontitis during the retention period after tooth movement and accelerate the repair of periodontal tissue.

【Key words】 Psoralea Corylifolia Linn； Periodontitis； Tooth movement； Retention； Osteoprotegerin

First-authors address：Oral Medicine College Jiamusi University，Jiamusi 154000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.15.008

隨著經(jīng)濟(jì)社會(huì)的發(fā)展，人們對(duì)于美觀的要求不斷提高，存在錯(cuò)頜畸形癥狀的成人正畸患者數(shù)量逐年增加，其中多數(shù)患者伴有不同程度的牙周疾病。由于牙周炎會(huì)導(dǎo)致牙周支持組織的病損，正畸主動(dòng)治療后牙周組織的恢復(fù)與適應(yīng)將需要更長(zhǎng)的時(shí)間。如何將中藥應(yīng)用于正畸領(lǐng)域，近年來(lái)逐漸引起研究人員的關(guān)注。中草藥補(bǔ)骨脂（Psoralea Corylifolia Linn）為豆科類植被，味辛、苦，大溫，無(wú)毒，有補(bǔ)腎行氣、縮尿止帶、健脾止瀉的功效[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明其不僅具有雌激素樣作用，還具有促進(jìn)骨形成和抑制骨吸收的作用[2]。同時(shí)補(bǔ)骨脂因其藥效，對(duì)預(yù)防骨質(zhì)疏松癥也有作用[3-5]。由成骨類細(xì)胞分泌的OPG（Osteoprotegerin），能抑制破骨細(xì)胞（Osteoclast，OC）形成和激活，減少牙槽骨破骨性的吸收。本文實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)將補(bǔ)骨脂水煎液應(yīng)用在牙周炎大鼠牙移動(dòng)保持期，觀察OPG表達(dá)變化，研究補(bǔ)骨脂在炎性牙周改建過(guò)程中的作用，為牙周炎患者正畸后縮短保持時(shí)間提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 每1 000 mL水中加100 g補(bǔ)骨脂干燥果實(shí)（購(gòu)自陜西，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所鑒定符合2015版《中國(guó)藥典》補(bǔ)骨脂質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)）浸泡30 min，加熱至沸騰半個(gè)小時(shí)后濾渣，將濾液濃縮至100 mL，即制成100%濃度的水煎劑，備用（含1 g生藥/mL）。DAB顯色劑、兔抗多克隆一抗（武漢博士德生物工程有限公司），二抗PV6001（北京中杉金橋生物科技有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用8周齡健康雄性Wistar大鼠50只[購(gòu)于佳木斯大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)：SCXK（黑）2013-001]，體重（220±20）g，適應(yīng)環(huán)境1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，最終納入45只。

1.3 方法

1.3.1 分組 按照隨機(jī)數(shù)字表法將45只建立牙周炎的大鼠分為3大組，每組15只，共9小組?？瞻讓?duì)照組：將建立牙周炎后的大鼠牙移動(dòng)21 d后處死。陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組：各4小組（每一保持時(shí)間點(diǎn)設(shè)置1小組），牙周炎大鼠牙移動(dòng)21 d后去除加力拉簧，在上頜左側(cè)第一磨牙與前牙間安放保持器，分別保持3、7、14、21 d，于保持前1 d以補(bǔ)骨脂水煎液開(kāi)始灌胃實(shí)驗(yàn)組大鼠，劑量為5.6 g/kg（約5.6 mL），1次/d，直到處死。無(wú)菌生理鹽水等量灌胃陰性對(duì)照組大鼠。

1.3.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕?/p>

1.3.2.1 建立大鼠牙周炎模型 以10%水合氯醛（佳木斯大學(xué)口腔醫(yī)院藥房提供）腹腔注射大鼠（3.5 mL/kg），動(dòng)物安靜后仰臥于操作臺(tái)，拴牢頭部和四肢，用自制開(kāi)口器暴露視野，使用快速手機(jī)在大鼠雙側(cè)第一磨牙頸部頰腭方向靠近齦緣的地方制備一0.2 mm深固位溝，用0.2 mm結(jié)扎絲（正畸用型號(hào)）分別圍著大鼠第一磨牙頸部一圈實(shí)施結(jié)扎，在腭方結(jié)扎并將結(jié)扎頭盡量埋入齦溝里，待大鼠清醒后飼以高糖飲食4周。每天檢查，如有損壞丟失及時(shí)重置。

1.3.2.2 建立大鼠牙移動(dòng)模型 參照林鵬等[6]的方法，在大鼠上頜兩顆前牙的唇舌面以及遠(yuǎn)中側(cè)距離齦緣約0.5 mm處用快速手機(jī)磨出約0.2 mm的深溝。用0.2 mm正畸鋼絲穿入鎳鈦拉簧后，一端通過(guò)前兩顆磨牙之間于腭側(cè)結(jié)扎，另一端嵌入中切牙固位溝內(nèi)，用測(cè)力計(jì)測(cè)量，對(duì)第一磨牙向近中施加約50 g力后唇側(cè)結(jié)扎，并用玻璃離子固定，連續(xù)牽拉21 d后去除拉簧。每天檢查口內(nèi)裝置，如有損毀丟失應(yīng)及時(shí)重置。

1.3.2.3 建立牙移動(dòng)后保持模型 牽引21 d后去除大鼠口內(nèi)裝置，以上頜左側(cè)牙弓作為保持側(cè)，在左側(cè)第一磨牙與中切牙間，使用0.25 mm正畸鋼絲安放保持裝置，右側(cè)不保持。分別保持3、7、14、21 d，每一時(shí)間點(diǎn)處死5只，保持期間每天檢查口內(nèi)裝置，如有脫落及時(shí)補(bǔ)救[7]。

1.3.3 免疫組化 以過(guò)量水合氯醛腹腔注射大鼠麻醉處死，解剖取出含磨牙區(qū)的上頜骨，修剪后固定于4%多聚甲醛液（北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司，編號(hào)：AR-0211）24 h。之后浸泡于10%EDTA液（廣州行知生物科技有限公司，編號(hào)：AAPR16-500）中于4 ℃脫鈣約50 d，PBS沖洗干凈組織塊后石蠟包埋。以平行牙體長(zhǎng)軸，從腭側(cè)向頰側(cè)的方向進(jìn)行切片，獲取近遠(yuǎn)中方向切片，選擇斷面為完整牙周韌帶進(jìn)行觀察。OPG表達(dá)量以平均光密度（OD值）代表，每例牙根遠(yuǎn)中側(cè)隨機(jī)分析3個(gè)不同的高倍鏡視野，取其平均值，該值越大，代表OPG表達(dá)越強(qiáng)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 20.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗(yàn)。采取多因素方差方法分析比較時(shí)間和藥物因素對(duì)OPG表達(dá)量的影響，LSD多重檢驗(yàn)方法對(duì)各組內(nèi)不同時(shí)間段OPG表達(dá)量分析對(duì)比，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2 結(jié)果

2.1 觀察免疫組化切片 OPG以淡黃色、淺棕色粒狀為主呈現(xiàn)于胞漿和胞質(zhì)中，上頜第一磨牙遠(yuǎn)中側(cè)牙周組織中都有OPG表達(dá)，且在牙槽骨表層的骨細(xì)胞以及牙周膜細(xì)胞中都可見(jiàn)不同程度的陽(yáng)性表現(xiàn)。

2.2 大鼠正畸牙遠(yuǎn)中側(cè)牙周OPG免疫組化分析統(tǒng)計(jì) 藥物和時(shí)間因素對(duì)牙周炎大鼠正畸牙遠(yuǎn)中側(cè)牙周OPG表達(dá)的影響，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。陰性對(duì)照組OPG的表達(dá)在早期變化不顯著，3 d隨后不斷遞增，而實(shí)驗(yàn)組在整個(gè)保持階段呈不斷遞增的趨勢(shì)。兩組在同一時(shí)段進(jìn)行比較，在3、7、14、21 d比較，實(shí)驗(yàn)組遠(yuǎn)中側(cè)OPG的表達(dá)均明顯大于陰性對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表1。

3 討論

牙周炎（chronicperiodontitis，CP）是一種由緊貼在牙根表面的菌斑生物膜引起的，呈現(xiàn)出慢性炎癥反應(yīng)的疾病。其主要臨床特征是牙槽骨、牙周膜等牙周支持組織的破壞[8]。牙周炎患者正畸治療后，牙周組織修復(fù)要比正?；颊咝枰L(zhǎng)的時(shí)間，才能使移動(dòng)后的牙齒穩(wěn)固在新的位置上。為防止復(fù)發(fā)，有些牙周病損嚴(yán)重的患者需要長(zhǎng)期甚至一生佩戴物理保持裝置。當(dāng)前許多國(guó)內(nèi)外研究證明采用藥物可以控制牙齒的移動(dòng)，降低正畸后牙齒的復(fù)發(fā)，此類藥物包括西藥，如辛伐他?。⊿imvastatin）、二磷酸鹽等[9-10]。而中草藥從古至今被我國(guó)人們廣泛使用，相對(duì)于西藥，中藥不容易產(chǎn)生耐藥性，藥效溫和，毒副作用小等這些特點(diǎn)，使中藥的開(kāi)發(fā)和利用逐漸得到國(guó)內(nèi)外研究人員的關(guān)注，如淫羊藿、黃芩苷、川芎嗪等[11-13]。目前許多研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)骨脂活性成分能直接或間接的影響成骨相關(guān)因子的表達(dá)，加快成骨細(xì)胞（osteoblast，OB）增殖，或者通過(guò)上調(diào)OPG表達(dá)量，減緩OC的形成，間接地影響骨的代謝[14]。近年來(lái)，通過(guò)不斷探索補(bǔ)骨脂對(duì)牙周炎的影響發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)骨脂能發(fā)揮雌激素樣作用，減緩牙槽骨的吸收，加快OB的增殖，增加牙槽骨密度，促進(jìn)了受損牙周組織的重建[15]。此外，補(bǔ)骨脂還具有明顯的抗炎性，可抑制炎性細(xì)胞分泌的各種黏附因子和細(xì)胞因子的釋放[16]。

骨保護(hù)素（osteoprotegerin，OPG）亦名OC生成抑制因子，經(jīng)分子克隆技術(shù)發(fā)現(xiàn)的一種與骨密度調(diào)節(jié)有關(guān)的分泌性糖蛋白，是TNF超家族的一種受體。OPG可作為誘餌與RANK競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合RANKL，導(dǎo)致與OC表面受體RANK相結(jié)合的RANKL數(shù)量的減少，抑制了OC的增殖分化及成熟，使OC的生成量相對(duì)降低，減緩了骨的吸收[17]。OPG在口腔中遍布較為廣泛，牙周支持組織均可以測(cè)到OPG的表達(dá)[18]。因此，OPG可以作為衡量骨改建活躍程度的一個(gè)指標(biāo)。牙周炎可打破骨代謝的均衡，導(dǎo)致牙周骨組織吸收。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，OPG是牙周炎的重要調(diào)節(jié)因子，其參與牙周炎骨組織吸收活動(dòng)。鐘雯怡等[19]將重組人骨保護(hù)素（rhOPG）局部注射于牙周炎大鼠磨牙牙周袋間隙，發(fā)現(xiàn)牙周炎大鼠牙槽骨中OPG表達(dá)量明顯提高，RANKL的表達(dá)量降低，這可能是改變了受損牙牙周骨組織重建過(guò)程中OPG/RANKL的平衡，使成骨大于破骨，有助于牙周炎患者受損牙周骨組織的修復(fù)。

通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，以補(bǔ)骨脂水煎液劑量為5.6 g/kg（約5.6 mL）給予大鼠灌胃，結(jié)果發(fā)現(xiàn)補(bǔ)骨脂可以抑制OB和骨髓基質(zhì)細(xì)胞RANKL表達(dá)，增加OPG表達(dá)量，表明中藥補(bǔ)骨脂可加快成骨作用[20]。本文以此為依據(jù)，實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組牙周炎大鼠隨著用藥時(shí)間的增加，OPG表達(dá)水平逐漸提高；在同一時(shí)間段組間比較，使用傳統(tǒng)結(jié)扎絲進(jìn)行物理保持的對(duì)照組牙周炎大鼠，其OPG表達(dá)水平均低于實(shí)驗(yàn)組，說(shuō)明在大鼠正畸牙保持期間，通過(guò)灌胃給予補(bǔ)骨脂水煎液能夠促進(jìn)牙周炎大鼠牙周組織中OPG蛋白的表達(dá)，這有助于加快成骨細(xì)胞的成骨活動(dòng)，增加牙槽骨的骨量，從而使移動(dòng)后的牙齒能夠更早地穩(wěn)固在新的位置。

本實(shí)驗(yàn)采用的補(bǔ)骨脂使用廣泛，并具有促骨形成作用的中藥，將其應(yīng)用到牙周炎患者正畸治療后牙齒的保持階段，與傳統(tǒng)物理保持相配合下，該中藥能夠縮短牙周炎患者正畸治療后牙齒的保持時(shí)間，使正畸治療后的效果得到鞏固和維持，降低復(fù)發(fā)的可能性，使正畸患者接受正畸治療的整個(gè)時(shí)間得到縮短。目前隨著對(duì)中藥補(bǔ)骨脂的深入研究，其包含的眾多有效成分被不斷開(kāi)發(fā)和利用，相信在口腔正畸領(lǐng)域也將會(huì)有巨大的應(yīng)用價(jià)值。

參考文獻(xiàn)

[1]中華人民共和國(guó)藥典編委會(huì).中華人民共和國(guó)藥典2015[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015.

[2]李凱明，郝延科.補(bǔ)骨脂抗骨質(zhì)疏松癥的研究進(jìn)展[J].中醫(yī)藥臨床雜志，2016，28（6）：886-889.

[3] Yuan X，Bi Y，Yan Z，et al.Psoralen and Isopsoralen Ameliorate Sex Hormone Deficiency-Induced Osteoporosis in Female and Male Mice[J].Bio Med Research International，2016（4）：1-8.

[4]柴麗娟，樊娜，王虹，等.補(bǔ)骨脂單體成分對(duì)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞分化的影響[J].天津中醫(yī)藥，2015，32（5）：299-303.

[5]黃奎，鄒季.補(bǔ)骨脂素對(duì)骨質(zhì)疏松小鼠骨代謝指標(biāo)和生物力學(xué)的影響[J].生物骨科材料與臨床研究，2017，14（6）：11-21.

[6]林鵬，郭新星，魏竹亮.局部注射黃茋多糖對(duì)大鼠正畸牙保持階段BMP-2表達(dá)的影響[J].口腔醫(yī)學(xué)研究，2017，33（5）：520-524.

[7]姜雨君，徐山山，丁曉華，等.辛伐他汀對(duì)牙周炎大鼠正畸牙移動(dòng)保持階段MMP-1表達(dá)影響的研究[J].北京口腔醫(yī)學(xué)，2015，23（2）：92-95.

[8] Friedewald V E，Kornman K S，Beck J D，et al.The American Journal of Cardiologyand Journal of Periodontology Editors Consensus：periodontitis and atherosclerotic cardiovasculardisease[J].Journal of Periodontology，2009，104（1）：59-68.

[9]丁曉華，莊金良，姜雨君，等.辛伐他汀對(duì)大鼠正畸牙保持階段牙周組織中BMP-2表達(dá)的影響[J].口腔醫(yī)學(xué)研究，2014，30（4）：306-310.

[10]任旭，升徐杰.王旭霞，等.二磷酸鹽局部注射對(duì)去勢(shì)正畸牙大鼠牙周組織改建的影響[J].山東醫(yī)藥，2013，53（3）：28-30.

[11]趙剛，柴傲然，付雅楠，等.淫羊藿對(duì)牙移動(dòng)后保持階段牙周組織BMP-2的表達(dá)影響[J].中國(guó)體視學(xué)與圖像分析，2016，21（3）：332-339.

[12]李玲.黃芩苷對(duì)牙周炎大鼠牙移動(dòng)保持階段VEGF、BMP-2及IL-1β表達(dá)的影響[J].中國(guó)生化藥物雜志，2015，35（3）：33-34.

[13]郭睿，阮薔，魯微，等.局部注射川芎嗪對(duì)大鼠牙移動(dòng)保持階段骨保護(hù)素的表達(dá)[J].中國(guó)組織工程研究，2016，20（24）：3574-3580.

[14]劉小鈺，宋敏，蔣林博，等.補(bǔ)骨脂活性成分對(duì)骨質(zhì)疏松相關(guān)信號(hào)通路影響的研究概況[J].中國(guó)骨質(zhì)疏松雜志，2017，6（23）：831-836.

[15]朱建華，遲玉紅，張秋燕，等.去卵巢牙周炎模型大鼠牙槽骨吸收與補(bǔ)骨脂的干預(yù)[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2011，15（41）：7607-7610.

[16]柴麗娟，王安紅，徐金虎，等.補(bǔ)骨脂4種組分對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥因子的影響[J].中國(guó)新藥與臨床藥理，2013，24（4）：360-363.

[17] Nakamura M，Udagawa N，Matsuura S，et al.Osteoprotegerin regulates bone formation through a coupling mechanism with bone resorption[J].Endocrinology，2003，144（12）：5441-5449.

[18] Anderson D M，Maraskovsky E，Billingsley W L，et al.A homologue of the TNF receptor and its ligand enhance T-cell growth and dendritic-cell function[J].Nature，1997，390（6656）：175-179.

[19]鐘雯怡，武岐山，高麗，等.重組人骨保護(hù)素對(duì)牙周炎大鼠牙槽骨RANKL、OPG蛋白表達(dá)的影響[J].重慶醫(yī)學(xué)，2015，44（14）：1879-1881

[20]王瑩.巴戟天、葫蘆巴和補(bǔ)骨脂對(duì)去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥的作用及機(jī)理探討[D].北京：中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院，2013.