陳雅涵 謝宗強

（中國科學院植物研究所植被與環(huán)境變化國家重點實驗室，北京 100093）

土壤是地球生物圈的重要組成部分，與有機生命和無機環(huán)境均有密切聯(lián)系，是物質循環(huán)和能量轉化的活躍場所。土壤的生化指標定量反映了土壤系統(tǒng)的各項功能，例如營養(yǎng)物質與水分的含量、土壤生物與酶的活性、污染物的吸附與轉化等，反映了土壤的肥力、物質循環(huán)與能量流通的水平、凈化能力等。土壤生化指標對生態(tài)系統(tǒng)結構與功能、生物地球化學循環(huán)的理論研究以及農業(yè)、林業(yè)生產(chǎn)實踐均有重要的意義［1-2］。

針對不同的研究目的和測試指標，土壤樣品需要經(jīng)過不同的前處理和一段時間的保存后進行測試［3］。土壤樣品保存的時間從數(shù)天至上百年不等。樣品需要進行短期保存的原因通常是由于采集樣品的野外缺乏實驗條件，或由于土壤具有異質性，需要經(jīng)過風干、混勻、過篩等處理再進行測試，因此樣品需短期保存與處理再進行測試，保存時間通常為數(shù)天至數(shù)月。針對特定的研究需求，土壤樣品也需要經(jīng)過長時間的保存，長達數(shù)年甚至上百年，例如：土壤類標準樣品需要進行長期穩(wěn)定的保存，保證元素價態(tài)和形態(tài)分析、持久性有機污染物等指標的穩(wěn)定性［4］；土壤普查樣品需要長期保存，保障數(shù)據(jù)復查與保存土壤環(huán)境資源信息［5］；生態(tài)學與環(huán)境科學長時間序列的比較研究［6-10］也促進了土壤樣品長期保存的需求。

目前世界各地建有多個大規(guī)模的土壤樣品庫，例如英國洛桑實驗站保存了1843年以來多個定位實驗的超過30萬份土壤和植物樣品［11］，荷蘭瓦格寧根大學和研究中心保存了1879年以來多個研究項目的土壤、作物和肥料，其中土壤樣品約25萬份［12-13］。國內也有多個覆蓋全國各土壤類型的大規(guī)模土壤樣品庫，例如中國科學院南京土壤研究所土壤標本館建立于1953年，收藏有研究用瓶裝標本約5萬件［14］；中國環(huán)境監(jiān)測總站的國家臨時土壤樣品庫建于2010年，保存了全國“七五”土壤普查背景值樣品約1.5萬份，土壤調查樣品超過5萬份［5］；中國科學院植物研究所自然生態(tài)系統(tǒng)樣品庫建于2011年，保存了全國典型生態(tài)系統(tǒng)土壤與植物樣品超過10萬份，其中土壤樣品約5萬份［15］。

樣品庫中土壤樣品的生化指標反映了樣品采集時期的生態(tài)與環(huán)境信息，具有極為重要的科學研究價值，但樣品保存過程中生化指標是否發(fā)生變化是保存樣品應用中應關注的重點問題［16］。目前對保存樣品的應用存在爭議，有研究認為土壤保存對土壤生化指標有影響，不適用于長時間序列的比較研究［17-18］，也有研究認為盡管土壤保存后生化指標會發(fā)生顯著變化，但不同環(huán)境因素下采集的土壤之間仍存在差異，保存土壤仍可應用于研究環(huán)境因素對土壤功能的影響［12，19］。

由于各組織建設土壤樣品庫的目的不同，保存方法和保存時間也有所差別，必須了解樣品在不同保存過程中生化指標發(fā)生的變化，以指導土壤保存樣品在科學研究中的應用。土壤樣品有多種保存方法，包括保存溫度、土壤狀態(tài)等方面。常見的樣品保存溫度包括-85℃冷凍、-20℃冷凍、4℃冷藏以及20～25℃常溫保存。土壤狀態(tài)包括樣品是否風干、樣品過篩粒徑等。本文總結了各類土壤生化指標在不同保存方法、保存時間下的變化，并據(jù)此提出土壤保存樣品適用的研究范圍以及應用保存樣品需要注意的問題。

1 土壤生化指標保存后的變化

1.1 土壤碳、氮、磷元素

土壤碳、氮、磷元素與土壤肥力密切相關，是碳、氮、磷循環(huán)的重要組成部分。碳、氮、磷的全量元素含量在風干土壤長期保存過程中保持穩(wěn)定。例如風干土壤的全碳、全氮含量在保存4年、16年、32年后無顯著變化［16，20-21］，風干土壤的全氮含量在保存37年后無顯著變化［22］，風干土壤的全磷含量在保存41年后無顯著變化［17］（表1）。

土壤有機碳含量也比較穩(wěn)定。研究表明保存2年以上的風干土壤，無論常溫避光、4 ℃冷藏或－20 ℃冷凍保存，土壤有機質均無顯著變化［23-24］。土壤有機碳根據(jù)在酸、堿溶液中溶解度的差異，分為富里酸、胡敏酸等組分，富里酸和胡敏酸的化學穩(wěn)定性高，分解速率非常緩慢，較老的胡敏酸的平均停留時間可達780～3 000年，富里酸的平均停留時間為200～630年［1］；核磁共振碳譜（13C-NMR）的研究結果顯示，風干保存103年的土壤，富里酸和胡敏酸的分布與新鮮采集并風干的土壤無顯著差異［25］。

土壤氮的兩個重要組分銨態(tài)氮與硝態(tài)氮保存后變化較大，一般采用新鮮土壤測試。鮮土若需要保存一段時間后再測試，冷凍較冷藏保存的測試結果穩(wěn)定，且保存時間不宜超過45天［26-29］。

與土壤碳、氮的轉化相關的土壤呼吸作用、硝化作用、反硝化作用等土壤代謝過程也宜用新鮮土壤測試。即使是短期（＜8個月）冷藏或冷凍保存的土樣，其土壤呼吸作用、硝化作用、反硝化作用以及反映代謝活性的三磷酸腺苷(ATP)含量均有顯著變化且無一定規(guī)律［30-34］。

1.2 土壤金屬元素與pH

土壤金屬元素離子以可溶態(tài)、交換態(tài)、結合態(tài)等多種形態(tài)存在，其賦存狀態(tài)和化學轉化過程與土壤發(fā)生過程、微生物活性、植物根際化學等均有關，與土壤pH也密切相關。

多項研究均發(fā)現(xiàn)風干土壤長期（16年、20年、37年、41年、69年）保存后pH有顯著下降，但不同類型的土壤pH下降程度不一致。有研究認為酸性土壤、有機質豐富的土壤pH下降更顯著［16-17,20］，也有研究認為堿性土壤pH下降更顯著［35］（表1）。

土壤可交換金屬離子在保存過程中的變化沒有一定規(guī)律，故不適宜使用保存土樣測定金屬離子濃度。Blake等［20］研究發(fā)現(xiàn)風干土壤保存16年后鈣、鎂、鈉離子濃度無顯著變化，錳離子濃度則是保存前的兩倍。Berndt［36］發(fā)現(xiàn)風干處理和保存過程均使錳離子濃度顯著增加。隨著保存時間的延長，風干土壤保存32年后，鈣、鎂離子仍無顯著變化，鈉、鉀離子顯著變化，錳離子濃度仍是保存前的兩倍［16］。土壤金屬離子的不同價態(tài)、不同形態(tài)之間也會發(fā)生相互轉化，即使是短期（＜28天）保存過程中金屬離子的價態(tài)、形態(tài)變化也無一定規(guī)律［37］。

金屬元素總量則相對穩(wěn)定。保存30個月（常溫或-20℃）的風干土壤汞、鋅、銅含量與初值無顯著差異［24］，烘干、滅菌、密封保存12個月的土壤標準樣品砷、鋁、鋇、銅、鈷、鐵、錳、鎳、鉛、鈦、釩等21種重金屬含量均保持穩(wěn)定［38］。

1.3 土壤酶

土壤中的酶來自土壤微生物、土壤動物、植物根系與植物殘體等，包括水解酶、裂解酶、氧化還原酶、轉移酶等多種類型［1］。

不同種類的酶經(jīng)過土壤保存過程后，酶活性通常有所下降。有研究認為土壤樣品風干導致多數(shù)酶活性顯著下降［32，39］，隨著風干土壤保存時間的延長，酶活性繼續(xù)降低［40-41］（表1）。

但也有研究認為酶活性在風干保存過程中損失較小，即使酶活性有所下降，不同類型土壤酶活性的差異仍得以保留，可應用于對比研究。趙穎等［42］認為風干土壤的脲酶、蔗糖酶、多酚氧化酶活性與新鮮土壤無顯著差異，即使長期保存，酶活性損失通常較??；Dadenko等［40］的研究表明，風干土壤和新鮮土壤在不同的保存條件下，經(jīng)過7年的保存，過氧化氫酶、蔗糖酶、脫氫酶活性均降到較低水平，但酶活性的降低主要發(fā)生在保存初期，3個月后趨于穩(wěn)定，且下降程度與保存條件無關，不同類型土壤酶活性的差異得以保留，保存土壤仍可應用于大范圍的對比研究。

1.4 土壤微生物

土壤微生物是土壤中活躍的生物組分，其數(shù)量巨大、種類繁多，對土壤微生物的研究包括從整體角度考慮的土壤微生物量，從生物活性角度考慮的微生物代謝活性，以及從系統(tǒng)發(fā)生角度考慮的微生物群落結構等。有研究擬合了土壤微生物呼吸速率與樣品保存時間（14年至103年）的線性關系，推導出土壤樣品風干保存240年后土壤微生物仍具有活性［25］，但長期保存的風干土壤能否用于微生物的定量研究目前仍存在不同結論。

首先干燥處理過程對土壤微生物的影響有不同結論。有研究表明樣品干燥后重新加水培養(yǎng)微生物量與微生物群落結構均會發(fā)生顯著改變［18，43］，也有研究表明微生物量顯著變化而微生物群落結構無變化［44］，或總磷脂脂肪酸（PLFA，土壤微生物量的指標）無顯著變化而微生物群落結構改變［33，45］（表1）。

土壤保存過程對微生物的影響也存在不同結論。有研究認為與新鮮土壤比較，保存4個月的風干土壤和低溫凍存土壤微生物代謝能力降低、多樣性降低、群落結構改變［46］?；诜肿蛹夹g提取土壤RNA/DNA分析微生物群落結構則發(fā)現(xiàn)在不同溫度下保存14天以內的土壤微生物群落結構無顯著改變［47-48］，保存50年以上的風干土壤與新鮮土壤比較即使微生物量和微生物群落結構會發(fā)生變化，分子生物學方法也可以提取足夠的信息，進行長時間序列的土壤微生物研究［12,19,49-50］。

盡管風干保存過程對土壤微生物的影響存在不同研究結論，采用合適的土壤類型和分析方法，保存土樣仍可應用于土壤微生物的研究。首先土壤微生物對干燥具有適應性，尤其是干旱地區(qū)的土壤，微生物受干燥處理影響較小。因為自然條件下土壤都會經(jīng)歷長時間的干燥或反復的干燥、濕潤過程，土壤微生物活動在土壤干燥時中斷，重新濕潤時可迅速恢復［25］。研究表明干旱土壤中的微生物活性和微生物群落結構對土壤干燥處理更不敏感［51-52］。其次由于土壤中核酸物質的穩(wěn)定性，采用分子生物學技術可充分提取土壤微生物群落結構信息。研究表明土壤在4℃、濕潤和黑暗條件下儲存4年，DNA仍有轉化活性［53］；自然條件下固定在土壤黏粒表面的DNA可抗核酸酶的降解而在環(huán)境中持久存在［1］。土壤中核酸分子的穩(wěn)定性使利用分子技術分析保存土樣中的微生物信息成為可能。

1.5 土壤有機污染物

土壤中的有機污染物來自工業(yè)廢水排放、大氣沉降、農藥肥料施用、生活污水排放與生化垃圾堆放等多種途徑，部分有機污染物可通過生物吸收、降解等凈化，部分則被土壤顆粒吸附而不斷累積，在環(huán)境中滯留時間長，極難降解，這部分污染物稱為持久性有機污染物 (Persistent organic pollutants,POPs)。《關于持久性有機污染物的斯德哥爾摩公約》（簡稱《POPs公約》）列出了26種持久性有機污染物［54］，隨著化工技術與分析鑒定技術的發(fā)展，許多新型有機污染物不斷從各種環(huán)境介質中被發(fā)現(xiàn)，POPs的種類還在不斷增加中［55］。

POPs在土壤中的穩(wěn)定性已得到實驗證實。滅菌密封保存的干燥土壤標準物質在12個月有效期內有機氯農藥含量穩(wěn)定［56］；-85℃冷凍保存的土壤樣品有機氯農藥和有機磷農藥含量保存5年以上無顯著改變［57］；英國洛桑實驗站1881年采集的風干土壤樣品密封保存至1996年分析，檢出了多氯代二苯并二噁英(PCDDs)/ 多氯代二苯并呋喃(PCDFs)的含量，且排除了空氣污染、容器污染的可能［58］（表1）。

目前對土壤污染物的研究多關注于城郊、工礦、農田等人類活動密集的地區(qū)，但由于污染物可通過大氣、水遠距離乃至全球性傳播（“蚱蜢跳”效應）［59-60］，遠離人類活動的自然生態(tài)系統(tǒng)土壤也受到POPs污染。保存的自然生態(tài)系統(tǒng)土壤保留了樣品采集時環(huán)境污染物的信息，是POPs遷移、擴散、蓄積的重要研究對象。

表1 土壤生化指標在保存過程中的變化Table 1 Changes in soil biochemical properties during storage

續(xù)表

續(xù)表

2 土壤樣品保存方法

土壤樣品根據(jù)預計保存時間、分析測試目的的不同，應適用不同的保存方法。保存方法包括樣品的處理狀態(tài)，如過篩粒徑、是否風干、是否研磨等，以及保存條件，如樣品容器的選擇、環(huán)境溫度、濕度等。

樣品的處理狀態(tài)與土壤生化指標的穩(wěn)定性有密切聯(lián)系。其中土壤過篩的粒徑會對土壤微生物活性有影響。小粒徑樣品中微生物活動更活躍［31］，從而影響保存效果；而大粒徑樣品影響取樣的均勻性。按照土壤的定義以及土壤樣品生化分析的需求［3］，通常土壤樣品庫以保存過2 mm篩的土壤樣品為主。土壤樣品風干后保存或濕潤狀態(tài)下保存，土壤速效成分、微生物代謝活性均會發(fā)生改變，因此這些指標應使用新鮮土壤測定，或新鮮土壤低溫狀態(tài)保存后盡快測定［43，69-70］。長期存檔的樣品適宜風干后保存，以減少土壤中微生物活動，延緩土壤中化學物質分解速率［18，64］，保存盡可能多的土壤生化指標。

樣品保存條件中環(huán)境溫度的選擇尤為重要，應根據(jù)保存時間和分析目的的不同選擇合適的保存溫度。短期（＜8個月）保存的土壤樣品，各類生化指標在不同保存溫度下的保存效果并不一致，因此短期保存且有明確測試目的的樣品應根據(jù)測試指標選擇保存溫度。例如測定銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、可交換離子的樣品，冷凍保存效果優(yōu)于冷藏、常溫保存［26-28，36］；測定微生物生物量碳、呼吸的樣品，冷藏保存效果則優(yōu)于冷凍保存［31］；測定三價鐵還原性的土壤，22℃常溫保存效果則優(yōu)于冷藏保存［71］；測定酶活性的樣品，針對不同的酶、不同類型的土壤，均有不同的最適保存溫度使酶活性變化最小［40］。隨著保存時間的延長，長期保存的樣品在不同保存溫度下生化指標的變化趨于一致，保存溫度對保存效應的影響不明顯［21，40，64］。考慮到樣品長期保存的成本與管理因素，長期存檔的樣品適合常溫保存。

3 保存土樣的應用

3.1 保存土樣的應用范圍

保存土樣生化指標在保存過程中的變化如表1所示，保存土樣中碳、氮、磷及金屬元素的全量元素含量保持穩(wěn)定，土壤微生物可應用分子技術提取DNA/RNA序列分析微生物群落結構，土壤POPs難以降解可在土壤樣品中長期存在，因此長期保存的土壤樣品可適用于這幾方面的研究。土壤酶活性盡管在保存過程中會下降，但Dadenko等［40］的研究表明，酶活性下降僅發(fā)生在保存初期，其后保持穩(wěn)定，不同種類酶的活性差異得以保留，保存土樣仍可應用于大范圍的對比研究。

土壤速效成分以及呼吸、硝化等代謝過程相關指標在短期保存過程中有顯著變化且無一定規(guī)律，建議若條件允許使用新鮮土壤測試。土壤pH在多數(shù)保存土樣中均下降，不同種類的土壤下降程度不一致，因此土壤pH的長時間序列的比較研究應選用同一類型的土壤。

除應用保存土樣進行各類生化指標的定量分析外，保存土樣也可用于定性分析。隨著化學分析技術手段的發(fā)展，保存土樣中各類化學物質、微生物群落留存的歷史環(huán)境信息將得到進一步的揭示。

3.2 保存土樣的應用實例

英國洛桑實驗站，擁有最早且規(guī)模最大的土壤樣品庫，其保存土樣應用于多項長時間序列的研究。例如1949/1950年采集的保存土樣與同一地點重新采集土樣的pH、可交換陽離子、有機碳含量、氮含量進行比較，發(fā)現(xiàn)了采樣地區(qū)土壤化學性質的長期變化，且土壤酸化主要與地上植被類型有關，土壤碳庫與氮庫的增加主要與O層的厚度增加有關［22，72-74］。Blake和Goulding［75］分析了自1876年開始多次采集存檔的保存土樣，揭示了土壤重金屬累積的過程和主要影響因素。Blake等［76］分析了自1843年開始6個長期實驗樣地的保存土樣，揭示了長期的磷添加（通過施肥）或磷減少（通過移除地上農作物）對土壤磷元素不同組分的影響。

荷蘭瓦格寧根大學和研究中心的土壤樣品庫（TAGA）也擁有保存上百年的土壤樣品。Knapp等［77］提取TAGA保存土樣中的微生物DNA/RNA并分析抗生素抗性基因的豐度，發(fā)現(xiàn)自20世紀40年代開始，隨著醫(yī)學與農業(yè)領域抗生素的大規(guī)模生產(chǎn)和使用，土壤中抗生素抗性基因豐度大幅度增加，部分抗生素抗性基因豐度增加超過15倍。

保存土樣也用于研究環(huán)境中污染物的來源分布與變化趨勢。例如短鏈氯化石蠟(SCCPs)于2017年增列入《POPs公約》附件A中，中鏈氯化石蠟(MCCPs)迄今受到的關注較少，此前由于技術分析手段的限制，沒有早期的歷史數(shù)據(jù)可供比較。Bogdal等［78］利用保存的瑞士土壤，分析1989—2014年間土壤中SCCPs、MCCPs的變化趨勢，發(fā)現(xiàn)SCCPs濃度自1994年開始下降，反映了歐洲控制SCCPs生產(chǎn)使用以來的正面效應，但MCCPs濃度仍在持續(xù)增加中，需要引起更多的重視。Covaci等［79］對大氣-水-土壤系統(tǒng)的保存樣品進行α-HCH（六六六）的對映體分析，研究闡述了α-HCH的來源分布。由于手性農藥的對映異構體往往具有不同的生物活性、毒性、環(huán)境行為及殘留風險性，對映體分析提供了污染物來源、擴散途徑、分布等更進一步的信息。

3.3 保存土樣應用的注意事項

保存土樣應用時應注意以下幾方面的問題：避免樣品污染，選用合適的分析方法以及考慮不同類型土壤的保存效應。

首先應注意避免樣品受到污染。樣品污染有以下幾種可能途徑：（1）樣品保存時未完全密封，受到外界空氣或灰塵污染；（2）儲存容器的材料化學性質不穩(wěn)定或含有雜質，污染樣品；（3）樣品取出分析時暴露在空氣中受到污染［58，80］。為避免樣品污染應使用合適的儲存容器并保證完全密封，使用磨口玻璃瓶并用石蠟封口是合適的保存方式；樣品取出時應在無塵無菌環(huán)境中操作；取出樣品盡快完成分析測試以減少樣品暴露在當前環(huán)境中的時間。

選用合適的分析方法是獲得穩(wěn)定可靠的土壤生化指標的保證。應用保存土樣進行比較分析的重要優(yōu)勢是保證分析測試方法的一致性。由于分析技術手段的限制，有些土壤生化指標的歷史數(shù)據(jù)可能采用和現(xiàn)代不一樣的技術方法得到，因而不能直接和現(xiàn)階段的分析數(shù)據(jù)相比較［20，22］。針對保存過程中保持穩(wěn)定的生化指標，將保存土樣與新鮮采集土樣采用同樣的方法測試，可以有效避免分析技術、儀器設備前后不一致的問題，減少系統(tǒng)誤差。但應注意的是，即使是樣品保存過程中保持穩(wěn)定的生化指標，如果采用的分析方法不恰當，也無法得到穩(wěn)定的測試結果，保存后的測試數(shù)據(jù)無法反映保存前的土壤狀態(tài)。例如土壤中的有機污染物，在保存過程中難以降解，性質穩(wěn)定，但隨著時間的推移，會與土壤腐殖質緊密結合形成結合態(tài)殘留，解析率與可提取態(tài)殘留物明顯減少，若采用傳統(tǒng)的溶液浸提方式無法充分提取土壤中的污染物［1，81］。又例如土壤微生物碳有多種檢測方法，如熏蒸培養(yǎng)、基質誘導呼吸、ATP分析、PLFA分析等，采用不同的方法可能對土壤微生物碳做出不同的估計，保存土樣中微生物經(jīng)過休眠，即使重新培養(yǎng)也難以恢復保存前的代謝活性，ATP分析等基于微生物代謝過程的方法結果不穩(wěn)定，PLFA分析則是較為穩(wěn)定的分析方法［18，25，30，33，65，68，70］。

此外應考慮不同類型土壤的保存效應，針對某一指標的比較研究，應選用其他指標一致的同類型的土壤樣品。由于土壤形成因素與形成過程的不同，采自不同地點或同一地點采集的不同深度的土壤具有不同的組成、結構與生化性質。不同類型的土壤在同樣的保存過程中，生化指標可能發(fā)生不同程度的變化。例如土壤中腐殖質和黏粒含量影響污染物的降解速率和存在狀態(tài)［1，81］；土壤pH和礦物組成影響土壤有機質的穩(wěn)定性、重金屬的賦存狀態(tài)、土壤對重金屬的吸附能力等［1，82-83］；土壤有機碳含量影響土壤微生物在保存土壤中的存活率［25］。

4 展 望

除本文總結的幾大類常見生化指標外，利用現(xiàn)有的技術手段，土壤樣品還可以進行多方面的分析。例如土壤礦物質的晶體結構與化學成分、腐殖酸的化學結構與吸附解析特性、各類生物大分子如木質素、纖維素、蛋白質的含量等，均為土壤的發(fā)生、形成過程、功能提供更多研究信息。土壤樣品庫在做好樣品保存的同時，應充分利用已有分析技術，跟蹤檢測各類生化指標的變化，為保存土樣的應用提供更多依據(jù)。

隨著未來技術的發(fā)展，土壤科學也面臨快速的發(fā)展，新技術將促進土壤觀測與認識的飛躍，保存土樣將發(fā)掘出更多的利用價值。例如近紅外光譜分析技術可以對樣品進行無損分析，最大限度地利用保存土樣測定各類化學組分［84］；宏蛋白質組學技術可應用于考察土壤微生物的生態(tài)功能［85］；同位素分析技術、膠體化學方法、NMR電子顯微鏡、X射線衍射、質譜等技術，與計算化學模擬相結合，為土壤微觀結構、化學組成與轉化的研究提供了更多可能［86］。