李云霞,周 娜,王波云,成西霞,戴衛(wèi)紅

抗生丸是解放軍281醫(yī)院中藥制劑室自制制劑，由白芍、木瓜、牛膝、川楝子、紅花、甘草、川斷、千年健8味中藥加工制成，臨床上主要用于治療骨質增生，效果滿意。骨質增生在中老年人群中發(fā)病率較高，中醫(yī)認為，其病因主要是由于局部氣血不暢，骨骼氣血供養(yǎng)不足，發(fā)生增生、變粗，骨關節(jié)變壞等；長期負重、不良坐姿、外傷等也是其重要誘因。方中的白芍為君藥，主要用于骨痹的治療，補血止痛，配以木瓜，舒筋活絡，是中醫(yī)治療風濕痹癥常用的兩種配伍藥味；牛膝、川楝子、紅花、川斷、千年健具有補肝益腎、祛風止痛、活血化瘀，消腫止痛的功效[1-6]?？股柙|量標準落后，根據(jù)全軍醫(yī)療機構制劑標準提高計劃，對其質量控制方法進行研究。本研究對原標準中甘草的薄層鑒別方法進行優(yōu)化，增加紅花、木瓜、甘草和白芍4味藥材的顯微鑒別和薄層色譜(TLC)鑒別；建立以芍藥苷為指標成分的高效液相色譜(HPLC)含量測定方法，為該制劑建立更加科學全面的質量標準。

1 材料

1.1試驗儀器 安捷倫1100高效液相色譜儀(G1322型在線脫氣機、G1311A型二元泵、G1313A型自動進樣器、G1315B二極管陣列檢測器、A.08化學工作站，美國Agilent公司提供)，BX41型顯微鏡(日本奧林巴斯光學工業(yè)株式會社)，ZF-2型三用紫外儀(上海市安亭電子儀器廠)，BT214D型、BT125D型分析天平(北京賽多利斯科學儀器有限公司)，硅膠G薄層板(規(guī)格：100 mm×200 mm，青島海洋化工廠分廠)，LDZ5-2型離心機(北京京立離心機有限公司)；CQ-800B型超聲儀(上海躍進醫(yī)療器械有限公司)。

1.2試驗藥品 抗生丸(批號：20150302、20150506、20150602)及陰性樣品均由解放軍281醫(yī)院提供。白芍對照藥材(批號：120905-201109)，甘草對照藥材(批號：120907-201111)，木瓜對照藥材(批號：121003-201206)，熊果酸對照品(批號：110742-201421，純度：93.8%)，芍藥苷對照品(批號：110736-201438，純度：96.4%)，以上藥材均購自中國食品藥品檢定研究所；乙腈、甲醇(國藥集團化學試劑有限公司，色譜純)；其它試劑均為分析純。

2 試驗方法與結果

2.1顯微鑒別 取本品1丸，置顯微鏡下觀察：花粉粒圓球形或橢圓形，直徑約60 μm，外壁有刺，具3個萌發(fā)孔(紅花)。石細胞無色、淡黃色或橙黃色，直徑20～80 μm，層紋大多明顯，乳溝細，部分胞腔內(nèi)含棕色或紅棕色物(木瓜)。纖維束周圍薄壁細胞含草酸鈣方晶，形成晶纖維(甘草)。草酸鈣簇晶直徑18～32 μm，存在于薄壁細胞中，常排列成行，或一個細胞中含有數(shù)個簇晶(白芍)。見圖1。

圖1抗生丸粉末顯微鑒別特征

A.花粉粒(紅花，SP:250倍)，B.石細胞(木瓜，SP:250倍)，C.纖維束(甘草，SP:250倍)，D.草酸鈣簇晶(白芍，SP:250倍)

2.2TLC鑒別

2.2.1白芍的鑒別:取本品2丸加等量硅藻土研細，加乙醇50 ml，加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙醇1 ml使溶解，為供試品溶液。取缺白芍的陰性樣品2丸，同法制成陰性樣品溶液。取白芍對照藥材0.5 g，加乙醇10 ml，振搖提取10 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙醇1 ml使溶解，作為對照藥材溶液。另取芍藥苷對照品，加甲醇制成每1 ml含1 mg的對照品溶液。照薄層色譜法(《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則0502[7])試驗，吸取上述4種溶液各10 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40:5:10:0.2)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材和對照品色譜的相應位置顯相同顏色的斑點。陰性樣品無干擾。見圖2。

2.2.2甘草的鑒別[8-10]:取本品2丸加等量硅藻土研細，加乙醇50 ml，超聲處理30 min，置于室溫，過濾，濾液蒸干，藥物殘渣加水20 ml使溶解，用水飽和的正丁醇液振搖提取2次，每次20 ml，合并正丁醇液，再用正丁醇飽和的水洗滌2次，每次20 ml，棄去水層，正丁醇液蒸干，殘渣加乙醇1 ml使溶解，為供試品溶液。取缺甘草的陰性樣品2丸，同法制成陰性樣品溶液。另取甘草對照藥材1 g，加乙醇20 ml，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法(《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則0502[7])試驗，吸取上述3種溶液各5 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇(7:3:1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視，供試品色譜中在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。陰性樣品無干擾。見圖3。

圖2白芍薄層鑒別色譜圖

1,2,3-供試品，4-白芍對照藥材，5-芍藥苷對照品，6-缺白芍陰性樣品

圖3甘草薄層鑒別色譜圖

1,2,3-供試品，4-甘草對照藥材，5,6-缺甘草陰性樣品

2.2.3木瓜的鑒別[11-12]:取本品1丸加等量硅藻土研細，加二氯甲烷50 ml，超聲處理30 min，放至室溫，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇-三氯甲烷(1:3)混合液2 ml使溶解，作為供試品溶液。取缺木瓜的陰性樣品1丸，同法制成陰性樣品溶液。取木瓜對照藥材0.5 g，加二氯甲烷20 ml，同法制成對照藥材溶液。另取熊果酸對照品，加甲醇制成每1 ml含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則0502[7])試驗，吸取對照品溶液1～2 μl，另3種溶液各3～4 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-丙酮-甲酸(6:0.5:1:0.1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點顯色清晰，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點；在與對照品色譜相應的位置上，顯相同的紫紅色斑點。陰性樣品無干擾。見圖4。

2.3含量測定方法學研究[13-24]

2.3.1色譜條件:色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-水(12:88)；檢測波長：230 nm；流速：1.0 ml/min，柱溫：35℃；進樣量：20 μl。

2.3.2溶液的制備:①對照品溶液 取芍藥苷對照品約50 mg，精密稱定，置25 ml量瓶中，加稀乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液。精密量取對照品貯備液適量，用稀乙醇定量稀釋，制成濃度為50 g/ml的溶液，即得。②供試品溶液 取本品，剪碎，加等量硅藻土研磨成細粉，混勻，取約1 g，精密稱定，置50 ml量瓶中，加稀乙醇約40 ml，超聲30 min，冷卻至室溫，加稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，靜置，濾過，取續(xù)濾液，即得。③陰性對照溶液 按處方比例制備缺白芍的陰性對照樣品，按供試品溶液制備方法處理，制備陰性對照溶液。

圖4木瓜薄層鑒別色譜圖

1,2,3,4-供試品，5-木瓜對照藥材，6-熊果酸對照品，7,8-缺木瓜陰性樣品

2.3.3系統(tǒng)適用性試驗:取對照品溶液，連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖，見圖5(B)，考察重復性、分離度、理論板數(shù)。結果表明，芍藥苷色譜峰峰形良好，峰面積的RSD為0.58%，主峰與其他雜峰可實現(xiàn)完全分離，理論板數(shù)約為6000，滿足《中華人民共和國藥典》(2015年版)通則關于液相色譜法系統(tǒng)適用性試驗的要求[7]。

2.3.4專屬性試驗:取陰性對照溶液、對照品溶液和供試品溶液分別進行分析，記錄色譜圖。可見陰性樣品無干擾，表明該方法專屬性良好，見圖5。

圖5陰性對照溶液(A)、對照品溶液(B)和供試品溶液(C)的液相色譜圖1-芍藥苷色譜峰

2.3.5線性與范圍：取對照品貯備液逐級稀釋制成系列濃度的對照品溶液，分別精密吸取20 ul，按上述色譜條件進行分析，以進樣濃度C(μg/ml)為橫坐標，峰面積A為縱坐標，進行線性回歸，結果表明：芍藥苷在9.71～97.07μg/ml濃度范圍內(nèi)與峰面積有良好的線性關系。見表1。

2.3.6方法重復性：平行制備6份供試品溶液(批號：20150602)，依法測定，記錄色譜圖，計算芍藥苷的含量，6次含量測定結果的RSD為0.93%，表明該方法重復性良好。

2.3.7回收率試驗：精密稱取已知含量的供試品(批號：20150602)0.5 g，置50 ml量瓶中共9份，分別精密加入芍藥苷對照品溶液(0.6473 mg/ml)0.8、1.0、1.2 ml，各3份，用稀乙醇定量稀釋至刻度，搖勻，即得低、中、高濃度(80%、100%、120%)的溶液，分別進樣測定，按外標法以峰面積計算回收率。見表2。

表1 芍藥苷線性與范圍試驗測定結果

表2 芍藥苷加樣回收率試驗測定結果(n=9)

2.3.8溶液穩(wěn)定性:取供試品溶液(批號：20150602)，室溫放置，分別于0、2、4、6、8、10、12 h進樣，記錄峰面積，RSD為1.48%，結果表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.9含量測定結果:取3批供試品，按“供試品溶液”制備方法項下制備，每批樣品平行制備3份，依法測定，記錄色譜圖。結果見表3。本品每丸含白芍以芍藥苷(C23H28O11)計，不得少于17.7 mg。

表3 芍藥苷樣品含量測定結果(n=3)

3 討論

抗生丸為全藥材粉末入藥，研究中增加了4味藥材的顯微鑒別，專屬性強，方法簡便，用時短，可與薄層色譜鑒別相互印證與補充。

本制劑為大蜜丸，蜂蜜含量為50%，含糖量極高，在提取紅花進行鑒別時，無法將多余的糖分除去，提取液粘度很高，導致薄層鑒別無法正常展開，不能得到可辨識的正常色譜斑點，而在顯微鑒別項中，已有紅花的鑒別，因此不再進行紅花的薄層鑒別。原標準中，甘草的鑒別為三氯甲烷加鹽酸回流提取，以甘草次酸為對照品，但經(jīng)過反復試驗，供試品溶液幾乎未顯現(xiàn)相對應的斑點；后改用正丁醇提取，使用甘草對照藥材溶液，優(yōu)化展開條件后，最終可以得到滿意的結果。白芍的薄層鑒別中增加了白芍對照藥材，甘草和木瓜薄層鑒別中也均有相應的對照藥材，而非單一的使用對照品，這可使藥味成分更加全面，鑒別信息更加豐富，可信度增加。

白芍為君藥，用量約占處方量的一半，因此選擇白芍中的芍藥苷作為抗生丸含量測定的指標性成分?！吨袊幍洹分邪咨值暮肯薅纫?guī)定為，按干燥飲片計算，含芍藥苷的量不低于1.2%。按照參考轉移率不低于85%計算，抗生丸每丸最低含量為17.65 mg。因此規(guī)定本品每丸含白芍以芍藥苷(C23H28O11)計，不得少于17.7 mg。

試驗中采用流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液或乙腈-1%磷酸水溶液(含三乙胺0.23%)[7]時，峰形較差；換用乙腈-水系統(tǒng)，峰形得到明顯改善，經(jīng)過對流動相進行調(diào)整，最終確定以乙腈-水(12:88)為流動相。試驗中發(fā)現(xiàn)以甲醇為溶劑溶解對照品，色譜峰前沿嚴重，對稱度差；使用乙醇為提取溶劑，得到的樣品溶液雜峰較多，嚴重干擾了主峰的分離測定，改用稀乙醇作為提取溶劑，可以得到滿意結果。

綜上所述，本研究建立的抗生丸的顯微鑒別、薄層鑒別和含量測定方法操作簡便、結果準確、重現(xiàn)性好，可用于抗生丸的質量評價與控制。