王德華,劉云燕,李敏然,苗同國,孫杏麗,任桂芳
原發(fā)性肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一,惡性程度高,易發(fā)生侵襲轉移,預后差。近年來,隨著手術、介入治療、射頻消融治療等多手段的綜合應用,肝癌的治療得到進展;但由于該病起病隱匿,發(fā)展迅速,部分患者發(fā)現時已經失去了綜合治療的機會;因此,分子靶向藥物成為晚期肝癌的主要治療方法之一。索拉菲尼(SOR) 是一種多激酶抑制劑,一方面通過作用于Raf激酶直接抑制腫瘤細胞增殖,一方面通過作用于血管內皮生長因子受體、血小板源生長因子受體-β等抑制腫瘤新生血管生成,一定程度上抑制肝癌細胞生長[1-2]。肝癌的病程進展由多種細胞因子參與,而腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TRAIL)就是其中之一。TRAIL屬于腫瘤壞死因子(TNF)超家族,能誘導多種腫瘤細胞凋亡,但對機體正常細胞無毒性,故TRAIL被認為是TNF超家族最有潛能的抗腫瘤細胞因子。由于內源性或獲得性的TRAIL抵抗,使一些癌細胞對TRAIL誘導的凋亡發(fā)生了耐受。文獻報道,TRAIL聯合順鉑、阿霉素等化療藥物可增加肝癌細胞對TRAIL的敏感性[3-5]。但目前關于SOR聯合TRAIL作用于肝癌細胞的相關研究較少,故本文將觀察兩者聯合誘導肝癌細胞凋亡的情況。
1.1細胞株 肝癌細胞株SMMC-7721,購于中國科學院上海細胞生物學研究院,表型為低分化人肝癌細胞。
1.2主要試劑 SOR[N-(3-三氟甲基-4-氯苯基)-N-(4-(2-甲基氨基甲酰嘧啶)苯氧基)尿素](美國拜耳公司);四甲基偶氮唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)(Sigma公司);TUNEL凋亡試劑盒(北京中山生物技術公司);兔抗人Mcl-1多克隆抗體(美國Santa Cruz公司);HRP標記山羊抗兔IgG(北京中山生物技術公司);兔抗β-Actin多克隆抗體(美國Santa Cruz公司);硝酸纖維素膜(華美生物工程公司)。
1.3細胞培養(yǎng) 將肝癌細胞株SMMC-7721細胞放于含10%的新生小牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素、4 mmol/L谷氨酰胺及1 mmol/ml的HEPES(N-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙磺酸)混合成的RPMI-1640培養(yǎng)液中,置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞呈單層致密狀時,用0.04%的ETDA消化后以1∶3傳代,24 h換液,每3 d傳1次代,取對數生長期細胞用于實驗。
1.4比色法檢測細胞生長抑制率 取對數生長期細胞用0.25%胰蛋白酶消化后制備細胞懸液,以1×104個/孔,接種細胞到96孔細胞培養(yǎng)板。培養(yǎng)24 h細胞貼壁后分為3組,SOR組予不同濃度的SOR(0、1、2、4、8 μmol/L)進行干預,TRAIL組予不同濃度的TRAIL(0、10、100、500、1000 ng/ml)進行干預,聯合組予SOR和TRAIL聯合干預(劑量同前)。每組濃度均設4個重復孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h,每孔加入5 mg/ml的MTT,37℃、5%CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育4 h,小心吸棄上清液,每孔加入150 μl的DMSO,震蕩10 min后在酶聯免疫檢測儀上選擇570 nm波長測定各孔的吸光度值(A)。以未加藥的細胞株為對照組,計算各組細胞生長抑制率。生長抑制率(%)=(1-實驗組A值/對照組A值)×100%。
1.5流式細胞儀測定細胞凋亡率 將對照組(無血清培養(yǎng)基)、SOR干預組(2 μmol/L)、TRAIL干預組(100 ng/ml)及SOR聯合TRAIL組(2 μmol/L+100 ng/ml)分別作用肝癌細胞株SMMC-7721細胞24 h后,收集細胞,PBS清洗2次,離心,70%乙醇4℃固定,溴化己啶染色30 min,用流式細胞儀作凋亡分析。
1.6Western Blotting 分析 SDS-PAGE灌膠后加入電泳工作液中,上樣后電泳。電泳結束后轉膜。取出硝酸纖維素膜,在封閉液中4℃封閉過夜。封閉結束后,TPBS搖晃洗膜3次,以封閉液稀釋兔抗人Mcl-1多克隆抗體、兔抗β-Actin多克隆抗體,封膜機封口,4℃過夜。再次取出硝酸纖維素膜,TPBS振搖洗膜3次,以封閉液稀釋辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG。按每平方厘米膜加入0.1 ml第二抗體溶液,封口,室溫搖動孵育2 h。最后進行發(fā)光反應,X線膠片進一步顯影、定影即可見成像條帶。采用美國Kodak公司ID數碼成像分析系統(tǒng)軟件對Western blot結果進行定量分析,灰度值以積分光密度值(IOD)表示。
2.1SOR和TRAIL對肝癌細胞SMMC-7721增殖的影響 MTT法結果顯示,不同濃度SOR單獨處理肝癌SMMC-7721細胞24 h后,細胞生長抑制率隨著濃度的增加而逐漸增強,細胞抑制率均高于對照組(P<0.05)。不同濃度TRAIL單獨處理肝癌細胞SMMC-7721 24 h后,其細胞生長抑制率呈現劑量依賴性,各組之間細胞生長抑制率差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.05)。當SOR濃度為1 μmol/L時,細胞抑制率<10%,選擇1 μmol/L的SOR聯合不同濃度TRAIL處理肝癌SMMC-7721細胞24 h后,其抑制率均高于相同濃度TRAIL單藥處理組(P<0.05)。見表1。
注:SOR為索拉菲尼,TRAIL為腫瘤壞死因子相關凋亡配體
2.2SOR和TRAIL對肝癌細胞SMMC-7721凋亡的影響 對照組、SOR干預組(2 μmol/L)、TRAIL干預組(100 ng/ml)及SOR聯合TRAIL組(2 μmol/L+100 ng/ml)處理SMMC-7721細胞24 h,SMMC-7721細胞的凋亡率分別為(2.01±0.58)%、(22.58±5.03)%、(19.87±2.05)%與(45.86±3.01)%。3組藥物干預組細胞凋亡率均顯著高于對照組(P<0.1),SOR干預組的細胞凋亡率與TRAIL干預組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。而聯合組的細胞凋亡率顯著高于其他2組(P<0.05)。
2.3SOR和TRAIL對肝癌細胞SMMC-7721內Mcl-l蛋白表達的影響 Western blotting測定結果顯示,在40kD的位置出現一條雜交帶,43 kD處出現內參照β-actin的特異條帶。TRAIL干預組(100 ng/ml)、SOR干預組(2 μmol/L)及SOR聯合TRAIL組(2 μmol/L+100 ng/ml)處理細胞12 h后,聯合組Mcl-1表達水平顯著低于對照組。見圖1。
近年來,誘導腫瘤細胞凋亡是抗癌治療的熱門研究課題。TRAIL是1995年Wiley等[6]發(fā)現的TNF超家族中一個誘導凋亡的分子,它屬于Ⅱ型跨膜蛋白,廣泛表達于多種正常細胞,通過與不同的受體結合而發(fā)揮不同的生物學作用。Fabregat等[7]檢測人肝癌組織中TRAIL及其受體的表達,發(fā)現TRAIL在癌旁組織中的表達量最高,癌組織中次之,正常肝組織中無表達,其受體DR4、DR5的表達量在肝癌組織中顯著高于正常肝組織。這表明TRAIL是通過其受體DR4和DR5發(fā)揮抗肝癌作用。DR4和DR5具有與TNF受體超家族其他成員類似的胞質死亡區(qū),可與TRAIL特異性結合后,通過胞質中的死亡結構域激發(fā)和傳導凋亡信號,激活caspasesa參與的酶聯反應誘導細胞凋亡。DcR1無胞內區(qū),DcR2胞內區(qū)不完整,因此,雖然DcR1和DcR2可以與DR4、DR5競爭性結合TRAIL,不能傳導凋亡信號,反而抑制細胞凋亡[8]。
圖1索拉菲尼對SMMC-7721細胞內Mcl-l蛋白表達的影響
A為對照組,B為TRAIL干預組、C為索拉菲尼干預組、D為索拉菲尼聯合TRAIL組
TRAIL可誘導多種癌細胞凋亡,同時對正常組織沒有明顯的毒副反應[9]。本研究顯示,不同濃度TRAIL處理肝癌SMMC-7721細胞后,其細胞生長抑制率隨濃度的升高而增加,且一定濃度的TRAIL也可誘導細胞凋亡。目前有部分癌癥對TRAIL產生耐藥性,其耐藥機制包括細胞膜表面TRAIL受體的改變、某些miRNA的表達、Caspase氧化還原等原因[10-12]。因此,需尋找能特異性增強TRAIL誘導細胞凋亡作用的藥物。
SOR是目前世界上第一個被批準應用于臨床的分子靶抗癌向藥物,多項臨床試驗已證實SOR可延長肝癌患者的生存期及改善其預后[13-15];其作用機制之一在于靶向作用于腫瘤細胞及腫瘤血管上的Ras/Raf/MEK/ERK信號轉導通路,直接抑制腫瘤細胞生長;并且SOR可以阻斷腫瘤新生血管形成,同時起到抗腫瘤細胞和血管生長的雙重作用。文獻報道,SOR能抑制HepG2細胞株的Raf激酶活性,從而阻斷MEK/ERK信號轉導途徑,可降低細胞內cyclinD1水平,抑制癌細胞增殖[16]。本研究結果發(fā)現,不同濃度SOR處理肝癌SMMC-7721細胞后,細胞生長抑制率會隨著濃度的增加而逐漸增強,選擇一定濃度SOR聯合TRAIL處理細胞后,其抑制率均高于TRAIL單藥處理組。
SOR能抑制Raf/MEK/ERK信號傳導通路,降低elF4E磷酸化水平下調Mcl-1表達,從而誘導肝癌細胞株凋亡。Mcl-1是Bcl-2凋亡控制蛋白家族中的抗凋亡成員之一,可通過與Bcl-2蛋白家族中促凋亡成員如Bim、Bak等結合,組織線粒體釋放細胞色素C。另外,Mcl-l也可通過與截短的Bid結合阻斷內源性和外源性凋亡信號的交叉聯系。因此,諸多研究提示Mcl-l的表達在內源性和外源性凋亡信號通路中均起到重要作用[17]miR-26b可以負調控Mcl-1的表達,可增敏TRAIL誘導的肝癌細胞的凋亡,故miR-26b-Mcl-1可為肝癌治療的新通路[18]。而SOR與Apo2L/TRAIL受體激動劑抗體結合可增敏Apo2L/TRAIL抵抗細胞,亦增加Apo2L/TRAIL敏感細胞的致敏性,而Jak2-Stat3-Mcl1通路是SOR介導致敏化Apo2L/TRAIL的關鍵[19]。本研究結果顯示聯合組Mcl-1表達水平最低。
SOR或TRAIL于體外呈劑量依賴式抑制肝癌細胞的增殖,適量濃度的SOR聯合TRAIL可增強肝癌細胞的凋亡,其機制有可能通過Mcl-1這一結點發(fā)揮了協同作用。因此,本研究結果提示SOR聯合TRAIL可能為肝癌的治療提供新的治療方法,其具體機制有待進一步研究。