梁鵬鋒，岳樹(shù)強(qiáng)，李 霄

結(jié)直腸癌(Colorectal cancer, CRC)是世界范圍內(nèi)發(fā)病較高的惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率在男性中僅次于前列腺癌和肺癌，在女性中僅次于乳腺癌和肺癌[1]。近期資料顯示，我國(guó)結(jié)直腸癌發(fā)病率高達(dá)376.3/10萬(wàn)人，病死率為191.7/10萬(wàn)人，且預(yù)計(jì)未來(lái)10年將呈持續(xù)上升趨勢(shì)[2-3]。目前CRC的主要治療手段仍是以手術(shù)切除為主，但因缺少敏感的診斷指標(biāo)及方法，其早期診斷率較低。約25%的CRC患者在確診時(shí)已發(fā)生淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，手術(shù)切除率及遠(yuǎn)期生存情況均不理想。癌胚抗原(CEA)是目前CRC中檢出率最高的血清標(biāo)志物，但其臨床陽(yáng)性率僅為50%左右，具有一定的局限性[4-6]。尋找敏感性和特異性更強(qiáng)的標(biāo)志物，聯(lián)合CEA檢測(cè)以提高CRC的臨床早期診斷率并對(duì)預(yù)后進(jìn)行準(zhǔn)確判斷，是目前研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)問(wèn)題[7- 8]。粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)是生理狀態(tài)下參與骨髓造血的重要生長(zhǎng)因子之一，其主要生理功能是促進(jìn)骨髓前體細(xì)胞形成粒細(xì)胞集落，并誘導(dǎo)粒細(xì)胞的增殖、分化和遷移。但近期越來(lái)越多的研究顯示，G-CSF與肺癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、腦膠質(zhì)瘤等多種實(shí)體腫瘤的發(fā)生、惡性進(jìn)展有密切關(guān)系[9-13]。在食管癌、胃癌、膽囊癌、胰腺癌等消化系統(tǒng)腫瘤組織中，G-CSF的表達(dá)也顯著高于正常對(duì)照組織，且表達(dá)強(qiáng)度與患者的生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)[14-17]。但G-CSF在CRC患者外周血中表達(dá)情況及其檢測(cè)的臨床價(jià)值、意義卻報(bào)道不多。本研究收集了107例CRC患者的術(shù)前外周血并以結(jié)直腸腺瘤(Colorectal adenoma,CRA)患者及健康人群的外周血為對(duì)照組，檢測(cè)并對(duì)比血清中G-CSF含量的差異，以期為CRC的臨床早期診斷提供依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選取于2009年1月—2014年10月在陜西省渭南市中心醫(yī)院普通外科和西京醫(yī)院肝膽外科確診并接受外科手術(shù)治療的CRC 107例為CRC組。男66例,女41例；平均年齡(55.8±17.6)歲。腫瘤位于結(jié)腸58例，直腸49例?；颊咝g(shù)前均未施行化療或其他治療，術(shù)后經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)手術(shù)切緣為陰性。病理分級(jí)：高分化44例，中分化38例，低分化25例。根據(jù)2016年國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)發(fā)布的第八版結(jié)直腸癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)：I期29例，II期26例，III期47例，IV期5例。選取同期行外科手術(shù)治療的75例CRA為CRA組：男48例，女27例；平均年齡(53.2±22.5)歲。同期行健康查體人群120例為健康體檢組：男68例，女52例；平均年齡(49.9±19.3)歲。3組性別、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。3組均簽署同知情意書(shū)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2外周血標(biāo)本收集與處理 CRC組和CRA組于手術(shù)前1天，健康體檢組于查體當(dāng)天，抽取清晨空腹外周靜脈血4 ml，注入促凝管中室溫放置30 min，待其完全凝固并析出淡黃色血清后以4000轉(zhuǎn)/min 離心10 min，抽取上層血清，放入-80℃低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3病例隨訪情況 對(duì)于CRC組進(jìn)行術(shù)后隨訪，以手術(shù)當(dāng)天為隨訪開(kāi)始時(shí)間，采用電話隨訪或門(mén)診復(fù)查的方式進(jìn)行，隨訪終點(diǎn)為死亡日或至最后一次隨訪時(shí)間，隨訪截止日期為2017-09-12。至隨訪結(jié)束，共失訪病例11例，其中男5例，女6例。最終96例CRC患者完成術(shù)后隨訪及生存觀察，隨訪周期為3～73(43.9±21.1)個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為47.5個(gè)月，隨訪過(guò)程中，如果懷疑患者腫瘤復(fù)發(fā)，立即行結(jié)腸鏡檢查確診。

1.4血清G-CSF含量測(cè)定 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)各組血清G-CSF含量(試劑盒購(gòu)自美國(guó)RD公司)，操作方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)：將不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和3組待測(cè)血清樣本加入微孔反應(yīng)板中，100 μl/孔；各孔加入生物素化抗體工作液50 μl，振蕩混勻后室溫放置120 min；反應(yīng)結(jié)束后，將各孔內(nèi)液體吸干并反復(fù)洗滌5次；洗滌干燥后再加入酶結(jié)合物工作液100 μl/孔；振蕩混勻后室溫放置30 min；反應(yīng)結(jié)束后，將各孔內(nèi)液體吸干并反復(fù)洗滌5次；各孔再加入顯色劑A、B各50 μl，振蕩混勻，37℃下避光反應(yīng)顯色10 min；顯色結(jié)束后，加入終止液50 μl，振蕩混勻。最后，在490 nm的條件下以酶標(biāo)儀檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品各孔的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線后計(jì)算得到各組待測(cè)血清樣本內(nèi)的G-CSF含量。

2 結(jié)果

2.13組樣本血清G-CSF 的含量 CRC組、CRA組、健康體檢組的血清G-CSF含量分別為(205±32.3)、(84±12.6)、(16±5.1)pg/ml。CRC組和CRA組的血清G-CSF含量顯著高于健康體檢組(t=63.24、52.76，P<0.001)。CRC組血清G-CSF含量顯著高于CRA組(t=30.69，P<0.001)。

2.2血清G-CSF的Cut-off值及診斷價(jià)值 血清G-CSF 數(shù)值繪制的ROC曲線下面積(AUC)為0.656，95%CI為(0.584-0.729)。最大約登指數(shù)為0.392，此時(shí)靈敏度為0.469、特異度為0.923，G-CSF的Cut-off值為27.75 ng/ml。CEA的AUC為0.728，95%CI為(0.661-0.795)，最大約登指數(shù)為0.450，此時(shí)靈敏度為0.491、特異度為0.959。見(jiàn)圖1。G-CSF與CEA的AUC數(shù)值比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=1.279,P=0.095)。而將G-CSF和CEA的數(shù)值進(jìn)行聯(lián)合分析時(shí)，其靈敏度為0.592、特異度為0.973，最大約登指數(shù)為0.565。

根據(jù)ROC曲線分析確定G-CSF的Cut-off值為27.75 ng/ml，CEA的Cut-off 值采用臨床正常參考值，即5 ng/ml；若檢測(cè)值超過(guò)Cut-off 值則記為陽(yáng)性結(jié)果。據(jù)此，將96例CRC患者分為以下4組：A組G-CSF(+)/ CEA (+)，27例；B組G-CSF(+)/CEA(-)，18例；C組 G-CSF(-)/CEA(+)，23例；D組G-CSF(-)/CEA (-)，28例。A-D組患者的中位生存時(shí)間依次為27、49、50、65個(gè)月；生存時(shí)間依次為(34.3±19.7)、(43.7±20.8)、(45.9±20.0)、(51.8±19.6)個(gè)月。對(duì)4組生存情況進(jìn)行l(wèi)og-rank檢驗(yàn)分析，結(jié)果表明G-CSF(-) /CEA(-) 組生存時(shí)間最長(zhǎng)，G-CSF(+)/CEA (+) 組生存時(shí)間最短(χ2=11.505,P=0.009)。見(jiàn)圖3。

圖13組血清樣本中CEA和G-CSF含量的ROC曲線

注：CEA為癌胚抗原，G-CSF為粒細(xì)胞集落刺激因子

2.3CRC患者血清G-CSF含量與臨床病理特征的關(guān)系 以27.75 ng/ml為Cut-off 值，將96例CRC患者分為G-CSF高表達(dá)組45例和低表達(dá)組51例，在腫瘤直徑、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期等指標(biāo)中，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見(jiàn)表1。

2.4CRC患者血清G-CSF含量與生存情況的關(guān)系 高表達(dá)組生存時(shí)間為(38.0±20.7)個(gè)月，中位生存時(shí)間35個(gè)月；3 年及5年生存率分別為48.9%及26.7%。低表達(dá)組生存時(shí)間為(49.1±20.0)個(gè)月，中位生存時(shí)間58 個(gè)月；3年及5年生存率分別為68.6%及47.1%。G-CSF高表達(dá)組生存情況差于低表達(dá)組(χ2= 7.335,P=0.007)。見(jiàn)圖2。

表1 結(jié)直腸癌患者血清粒細(xì)胞集落刺激因子含量與臨床病理特征的關(guān)系

注：*為應(yīng)用Fisher精準(zhǔn)概率法

圖2CRC患者血清中G-CSF含量與生存情況的關(guān)系

注：CRC為結(jié)直腸癌，G-CSF為粒細(xì)胞集落刺激因子

圖3血清G-CSF聯(lián)合CEA分析結(jié)直腸癌患者生存情況

注：CEA為癌胚抗原，G-CSF為粒細(xì)胞集落刺激因子

3 討論

CRC的起病較為隱匿，早期基本無(wú)特異性臨床表現(xiàn)和癥狀，一旦出現(xiàn)明顯癥狀來(lái)醫(yī)院就診時(shí)，大多數(shù)患者又處于疾病進(jìn)展期或晚期，手術(shù)切除率較低。早期診斷是提高CRC療效的關(guān)鍵，但結(jié)直腸鏡開(kāi)展條件要求較高，而影像學(xué)檢查的特異性又差，尋找敏感而高效的分子診斷標(biāo)志物或聯(lián)合診斷方案，是目前的研究熱點(diǎn)與難點(diǎn)。

G-CSF屬于I類細(xì)胞因子受體超家族成員，其結(jié)構(gòu)為單次跨膜蛋白，包含免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞因子受體同源結(jié)構(gòu)域；生理情況下與粒細(xì)胞集落刺激因子受體(G-CSFR)結(jié)合后促進(jìn)多種造血細(xì)胞及非造血組織細(xì)胞的增殖、分化及遷移。但目前研究表明，在腫瘤環(huán)境中，G-CSF與G-CSFR結(jié)合后可激活多個(gè)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移。Morris等[18]在人胃癌細(xì)胞系的培養(yǎng)基質(zhì)中添加不同濃度的G-CSF重組蛋白，發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞的增殖活性顯著升高，且表現(xiàn)出劑量依賴性；進(jìn)一步在結(jié)腸癌細(xì)胞系中也重復(fù)出相似的結(jié)果，且G-CSF的促細(xì)胞增殖效果較胃癌更為明顯。在反向驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)利用G-CSF抗體中和G-CSF后，細(xì)胞增殖能力顯著降低。與此相似的實(shí)驗(yàn)，在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、膀胱癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞中也得到同樣的結(jié)果[19- 20]。G-CSF可能在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮類似促癌基因的功能，與多種腫瘤特別是消化系統(tǒng)腫瘤存在密切聯(lián)系，但其在CRC 患者血清中的表達(dá)規(guī)律及其臨床意義尚無(wú)相關(guān)研究報(bào)道。

本研究檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，CRC患者血清中G-CSF含量顯著升高，其診斷靈敏度、特異度與CEA比較無(wú)差異，但兩者聯(lián)合應(yīng)用時(shí)的靈敏度和特異度均有明顯提升，優(yōu)于單個(gè)指標(biāo)的檢測(cè)。本研究結(jié)果顯示：在CRC的早期診斷與篩查中，G-CSF與CEA的聯(lián)合檢測(cè)方案可能具有較好的應(yīng)用價(jià)值。進(jìn)一步的臨床病理指標(biāo)分析發(fā)現(xiàn)，G-CSF高表達(dá)組的患者群體腫瘤體積、分化程度和TNM分期等指標(biāo)均出現(xiàn)明顯進(jìn)展或惡化。而進(jìn)一步的生存分析也表明，G-CSF高表達(dá)組的3年和5年總體生存率顯著低于低表達(dá)組。本研究利用ROC曲線分析確定CRC患者體內(nèi)G-CSF含量的Cut-off 值，并聯(lián)合CEA對(duì)其生存情況進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，外周血呈雙陰性表達(dá)的CRC患者群體生存情況最好，而雙陽(yáng)性表達(dá)的CRC患者群體生存情況最差，表明這兩個(gè)標(biāo)志物的組合有助于判斷CRC患者的預(yù)后情況。

綜上所述，本研究初步明確CRC患者外周血中G-CSF的含量升高，提示腫瘤出現(xiàn)惡性進(jìn)展，且與癌細(xì)胞的增殖存在較密切的相關(guān)性。G-CSF可能是CRC早期診斷的潛在腫瘤標(biāo)志物，與CEA聯(lián)合檢測(cè)時(shí)可提高對(duì)CRC的診斷靈敏度和特異度，是一個(gè)具有良好潛在應(yīng)用前景的分子標(biāo)志物。