黃海波，沈圳煌，耿倩倩，史培穎，吳珍紅,4，孫燕如，韓鳴鳳，繆曉青,4,*

（1.福建農(nóng)林大學(xué)蜂療研究所，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；3.天然生物毒素國家地方聯(lián)合工程實驗室，福建 福州 350002；4.福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002）

順鉑由于其抗癌譜廣、作用強且可以和多種抗腫瘤藥物一同作用的特點，是目前最常用的抗腫瘤藥物之一[1]。但由于順鉑對細(xì)胞殺傷不具有特異性，因此在使用順鉑治療癌癥的同時也會對正常細(xì)胞造成損傷，產(chǎn)生較強的毒副作用[2]，這大大限制了順鉑在臨床上的運用。研究表明順鉑造成機體損傷的主要機制之一是氧化應(yīng)激作用，表現(xiàn)為順鉑可以降低抗氧化酶的活力，誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)生[3-4]。一些國內(nèi)外學(xué)者曾研究了藏紅花素[5]、燈盞花素[6]、咖啡酸苯乙酯[7]、蜂王漿[8]、槲皮素[9]、VC[10]、VE[11]等天然或人工合成的抗氧化劑對順鉑造成的損傷的保護作用，結(jié)果表明這些抗氧化劑可以很好地減少順鉑造成的損傷。

蜂膠是一種具有芳香氣味和黏性的膠狀固體物質(zhì)，在很久以前就已作為民間藥物使用[12]。蜂膠具有很好的抗氧化[13]、抗癌[14]、抗菌[15]、抗炎[16]、保肝[17]等生物學(xué)活性和藥理活性。尤其是抗氧化活性，近年來國內(nèi)外學(xué)者就蜂膠的抗氧化活性做了廣泛的研究，發(fā)現(xiàn)蜂膠能有效清除自由基，緩解機體的氧化應(yīng)激[13,18]?？Х人岜揭阴ァ㈤纹に乇徽J(rèn)為是蜂膠中的主要活性成分，蜂膠的許多生物活性均認(rèn)為與這些成分有關(guān)[19]。Kus[7]和Almaghrabi[9]等分別研究了咖啡酸苯乙酯、槲皮素等成分對順鉑毒性的干預(yù)作用，發(fā)現(xiàn)這些物質(zhì)可以有效干預(yù)順鉑所致的損傷。但目前國內(nèi)還沒有蜂膠干預(yù)順鉑誘導(dǎo)氧化損傷的報道。因此，本實驗將初步探究蜂膠對順鉑所致肝、腎損傷的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

成年健康雄性清潔級S D大鼠2 5 只，體質(zhì)量（180～200）g，購買于上海斯克萊實驗動物有限公司，動物合格證編號：2015000522002，許可證號碼：SCXK（滬）2012-0002。

粗蜂膠 神蜂科技有限公司；順鉑 濟南齊魯制藥有限公司；尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、肌酐（creatinine，Cr）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、鐵離子還原力法（the ferric reducing antioxidant power，F(xiàn)ARP）、2,2’-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）、聚氰基丙烯酸正丁酯（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度試劑盒、蘇木精-伊紅染色液 南京建成生物有限公司；戊巴比妥鈉、石蠟、無水乙醇、二甲苯、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TA203H普通天平 常州市幸運電子設(shè)備有限公司；3K15冷凍離心機 美國Sigma公司；SCIENTZ-48高通量組織研磨器 寧波新芝生物科技有限公司；T6新世紀(jì)可見光分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Infinite 200 PRO全波長酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司；YD-202組織切片機 浙江金華益迪醫(yī)療設(shè)備廠；B2032ED顯微鏡 重慶奧特光學(xué)儀器有限公司 ；LGJ-18S冷凍干燥機 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠；RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；DW-86L338超低溫冰箱青島海爾特種電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蜂膠提取物的制備

參考沈菲等[15]的方法略有修改。將粗蜂膠置于-20 ℃冰箱中冷凍2 h以上，使用中藥粉碎機粉碎后，按1∶10（m/V）加入體積分?jǐn)?shù)70%乙醇，浸漬96 h，過濾除雜。40 ℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙醇，然后放入60 ℃烘箱干燥至恒質(zhì)量。之后放入冷凍干燥機中-50 ℃下冷凍干燥，得到蜂膠提取物凍干粉（ethanolic extract of propolis，EEP）。

1.3.2 EEP成分及其抗氧化活性

1.3.2.1 總黃酮含量測定

根據(jù)王爍等[20]的方法，將2 m L稀釋后的E E P與0.4 m L 5% N a N O2反應(yīng)6 min后，加入0.4 mL 10% Al(NO)3，靜置6 min，再加入1 mol/L NaOH 4 mL，定容至10 mL，以蘆丁作為標(biāo)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，平行3 次測定樣品。

1.3.2.2 總酚含量測定

根據(jù)顏小捷等[21]的方法，使用福林-酚法對EEP總酚含量進行測定。將1 mL樣品與1 mL福林-酚反應(yīng)5 min后，加入1.5 mL 20% Na2CO3，加雙蒸水定容至10 mL，室溫避光放置10 min后于760 nm波長處測量，以沒食子酸作為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，平行3 次測定樣品。

1.3.2.3 ABTS+?清除實驗

根據(jù)試劑盒說明書測定EEP稀釋液的自由基清除能力。以Trolox作為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，平行3 次測定樣品。

1.3.2.4 FRAP總抗氧化能力實驗

根據(jù)試劑盒說明書測定EEP稀釋液的還原能力。以FeSO4?7H2O的水溶液作為標(biāo)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，平行3 次測定樣品。

1.3.3 動物分組及處理

SD大鼠飼養(yǎng)期間，環(huán)境溫度為（25±2）℃，可自由飲水和攝食。適應(yīng)性喂養(yǎng)5～7 d后，將25 只大鼠隨機分為5 組，每組5 只：對照組、模型組、蜂膠低、中、高劑量組。蜂膠給藥組每天分別給予50、100、150 mg/kg mb的蜂膠提取物。給藥前將蜂膠溶解在含有5%無水乙醇、10%吐溫-80的水溶液中。對照組、模型組每天灌胃等量不含蜂膠的溶劑。給藥周期為12 d，其中第7天給藥2 h后，除對照組外其余各組腹腔注射10 mg/kg mb的順鉑誘發(fā)肝、腎損傷；第13天早上大鼠麻醉后處死，取血液和肝、腎組織，用于后續(xù)各項指標(biāo)的測定和分析。

1.3.4 血清肝、腎功能指標(biāo)的測定

SD大鼠解剖后腹主動脈取血，待血液分層后，放在冷凍離心機中，4 ℃、3 000 r/min離心10 min制備血清。所得到的血清用試劑盒對AST、ALT活力和BUN、Cr含量進行測定。

1.3.5 肝、腎組織氧化應(yīng)激指標(biāo)及抗氧化酶指標(biāo)的測定

分別取0.1 g肝、腎組織，按1∶9（m/V）的比例加入預(yù)冷后的生理鹽水，使用高通量組織研磨器進行勻漿。勻漿后放在冷凍離心機中，4 ℃、3 000 r/min離心10 min。取上清液使用BCA蛋白濃度試劑盒測定10%勻漿液的蛋白濃度。之后按照試劑盒說明書分別對肝、腎組織勻漿液中SOD、CAT的活力，MDA、iNOS、GSH的含量進行測定。

1.3.6 肝、腎組織病理學(xué)檢驗

解剖后將大小適中的肝、腎組織浸泡在10%的中性甲醛溶液中，充分固定后經(jīng)脫水、浸蠟、石蠟包埋、切片、展片、撈片、烤片、脫蠟、復(fù)水、蘇木素染色、洗脫、伊紅復(fù)染、清洗、晾片、封片一系列步驟后，通過光學(xué)顯微鏡觀察肝、腎組織病理學(xué)的變化，使用顯微鏡數(shù)碼相機進行拍照。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 EEP的成分及抗氧化活性

測定結(jié)果表明實驗所用的E E P總黃酮含量為（122.35±7.40）mg/g、總酚酸含量為（241.42±9.80）mg/g。ABTS值為（466.1±12.7）mg/g（Trolox當(dāng)量）、FARP還原能力為2.35 mmol/g。

由測定結(jié)果結(jié)合玄紅專等[22]的報道可知實驗所用的蜂膠具有較高的總黃酮、總酚含量，具有較好的清除自由基和還原能力，是一個很好的天然抗氧化劑。

2.2 EEP對順鉑所致大鼠肝、腎功能損傷的影響

血清中AST、ALT、BUN、Cr含量的高低可分別反映肝臟、腎臟的損傷程度。由表1可知，模型組血清中AST、ALT活力和BUN、Cr的含量均高于對照組，且具有統(tǒng)計學(xué)意義。說明注射順鉑后，對大鼠的肝臟、腎臟造成了一定程度的損傷。而相比于模型組，蜂膠給藥組可以有效抑制順鉑對肝、腎造成的損傷。高劑量組血清中AST、ALT、BUN、Cr的數(shù)值與對照組相比仍有顯著性升高，但是明顯低于模型組，具有統(tǒng)計學(xué)意義。

表 1 蜂膠對順鉑導(dǎo)致肝、腎損傷大鼠血清BUN、Cr含量和ALT、AST活力的影響（n＝5）Table 1 Effect of EEP on serum BUN, Cr, ALT and AST levels in rats with cisplatin-induced hepatoxicity and nephrotoxicity (n= 5)

2.3 EEP對順鉑所致大鼠肝、腎組織SOD活力和MDA含量的影響

大鼠肝、腎組織中MDA含量可反映機體脂質(zhì)過氧化的情況，SOD作為體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)的主要酶類，它的活力高低直接反映機體清除自由基的能力[5]。

表 2 蜂膠對順鉑導(dǎo)致肝損傷大鼠肝組織勻漿SOD活力和MDA含量的影響（n＝ 5）Table 2 Effect of EEP on SOD and MDA in liver tissue of rats with cisplatin-induced hepatoxicity (n= 5)

表 3 蜂膠對順鉑導(dǎo)致腎損傷大鼠腎皮質(zhì)組織SOD活力和MDA含量的影響（n＝5）Table 3 Effect of EEP on SOD and MDA in renocortical tissue of rats with cisplatin-induced nephrotoxicity (n= 5)

由表2、3可知，模型組肝、腎組織中的SOD活力較對照組明顯降低，MDA含量有明顯升高。組織中SOD活力的降低會使脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強，而MDA含量的升高則會加劇脂質(zhì)過氧化速率，從而致使組織發(fā)生急性氧化損傷。當(dāng)給藥蜂膠后，大鼠肝、腎組織的氧化損傷情況有明顯好轉(zhuǎn)。低、中、高3 個劑量組中，肝、腎組織中的SOD活力較模型組均有顯著升高，活力與蜂膠給藥劑量呈正相關(guān)。蜂膠組肝、腎組織中MDA含量較模型組來說有所降低，其中高劑量組中MDA含量與模型組相比顯著性降低。說明給藥蜂膠后可以降低順鉑造成的氧化損傷。

2.4 EEP對順鉑所致大鼠肝、腎組織氧化應(yīng)激和抗氧化酶系的影響

表 4 蜂膠對順鉑導(dǎo)致肝損傷大鼠肝組織勻漿GSH含量、CAT、iNOS活力的影響（n＝5）Table 4 Effect of EEP on GSH, CAT and iNOS in liver tissue of rats with cisplatin-induced hepatoxicity (n= 5)

表 5 蜂膠對順鉑導(dǎo)致腎損傷大鼠腎皮質(zhì)組織GSH含量、CAT、iNOS活力的影響（n＝ 5）Table 5 Effect of EEP on GSH, CAT and iNOS in renocortical tissue of rats with cisplatin-induced nephrotoxicity (n= 5)

組織中iNOS活力可反映機體的氧化應(yīng)激情況，而體內(nèi)GSH的含量和CAT的活力可以反映機體的抗氧化能力[23]。由表4、5可知，模型組肝、腎組織中iNOS的活力較對照組有顯著提高，給藥蜂膠后組織中活力逐步降低，呈劑量依賴性關(guān)系，高劑量組較模型組顯著性降低。模型組的肝、腎組織中GSH的含量和CAT的活力較對照組顯著降低，給藥蜂膠后數(shù)值逐步升高，高劑量組較模型組顯著提高。實驗結(jié)果表明蜂膠可提高機體抗氧化酶的活力，從而有效降低順鉑引起的氧化應(yīng)激作用。

2.5 EEP對順鉑造成大鼠肝、腎組織病理學(xué)的影響

圖 1 大鼠肝臟組織病理學(xué)變化（100×）Fig. 1 Histological changes of liver tissue (100 ×)

由圖1可知，對照組大鼠的肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常。模型組則出現(xiàn)肝小葉壞死，肝細(xì)胞氣球性變性，伴隨著大量的炎性細(xì)胞浸潤。EEP給藥組較模型組損傷減輕，高劑量組減輕作用明顯，可見細(xì)胞整齊排列。

圖 2 大鼠腎臟組織病理學(xué)變化（100×）Fig. 2 Histological changes of kidney tissue (100 ×)

由圖2可知，對照組腎小管、腎小球清晰可見，沒有觀察到上皮脫落等癥狀。而模型組的腎臟組織出現(xiàn)明顯的腎小管病變情況，包括腎小管上皮細(xì)胞空泡變性，上皮細(xì)胞脫落，細(xì)胞間質(zhì)出現(xiàn)炎癥反應(yīng)。蜂膠給藥組大鼠腎臟病變情況較模型組有改善。高劑量組大鼠的腎臟結(jié)構(gòu)與正常大鼠腎組織接近。

3 討 論

順鉑是目前最常用的抗腫瘤藥物之一，可以通過抑制癌細(xì)胞的DNA復(fù)制過程、損傷細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)達(dá)到抗癌的作用，臨床上將其用于治療卵巢癌、睪丸癌、前列腺癌、肺癌等多種實體腫瘤[24]。但使用順鉑治療癌癥的同時也會對正常細(xì)胞造成損傷產(chǎn)生較強的毒副作用，對肝、腎、耳乃至神經(jīng)都會造成損傷[25-26]。

由于順鉑會對肝、腎造成一定程度的損傷，因此用AST、ALT、BUN、Cr這些臨床上判斷肝、腎是否正常的指標(biāo)來研究蜂膠對順鉑毒性的降低作用。AST和ALT是最常用于診斷肝細(xì)胞受損的指標(biāo)，它們的升高是肝細(xì)胞受損的重要標(biāo)志[27]。BUN、Cr是判斷腎功能的常用指標(biāo)，分別具有很高的敏感性和特異性，其值的高低可準(zhǔn)確反映腎功能的和損害程度，對于腎功能損傷早期診斷、治療和預(yù)后具有重要意義[28]。實驗結(jié)果表明，相比于對照組，模型組AST、ALT、BUN、Cr這些指標(biāo)均顯著提高，說明順鉑對大鼠的肝、腎造成了一定程度的損傷。而相比于模型組，蜂膠給藥組的這些指標(biāo)均顯著性降低，說明蜂膠提取物可以有效降低順鉑造成的肝、腎損傷。

此外，從肝、腎的組織病理學(xué)方面來看，相比于對照組，模型組的肝、腎組織都出現(xiàn)了病變情況，具體表現(xiàn)為肝小葉細(xì)胞壞死，腎小球細(xì)胞脫落、空泡性，肝、腎病理學(xué)切片中均發(fā)現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤等情況。而蜂膠給藥組的這些病變情況均有不同程度降低。由此可知，對大鼠給藥蜂膠提取物可以有效降低由于順鉑造成的肝、腎損傷。

研究表明氧化應(yīng)激是順鉑毒性的主要機制之一，活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）介導(dǎo)的氧化應(yīng)激在順鉑毒性中具有重要的作用[29]。一旦順鉑進入細(xì)胞內(nèi)，會使DNA和蛋白質(zhì)發(fā)生損傷，生成過量的ROS，導(dǎo)致生物膜正常功能被破壞[24]。順鉑能與抗氧化系統(tǒng)相互作用，影響抗氧化系統(tǒng)和抗氧化酶系，導(dǎo)致不同組織發(fā)生氧化損傷，氧化應(yīng)激反應(yīng)程度和組織結(jié)構(gòu)損耗的輕重呈明顯的正相關(guān)[30]。

正常情況下，機體內(nèi)產(chǎn)生的自由基會被細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶如SOD、CAT清除，從而保證機體內(nèi)自由基的生成和清除達(dá)到平衡[9]。當(dāng)機體內(nèi)自由基積累過多，不能及時被抗氧化酶類清除時，就會破壞自由基與機體防御系統(tǒng)之間的平衡，從而促進脂質(zhì)過氧化過程，引起細(xì)胞損傷。脂質(zhì)過氧化過程的主要產(chǎn)物是MDA，因此組織中MDA的含量可以一定程度上反映機體脂質(zhì)過氧化的程度，也間接表明機體內(nèi)自由基與抗氧化防御系統(tǒng)的平衡情況[10]。iNOS參與體內(nèi)NO的合成，當(dāng)機體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時iNOS的表達(dá)量增加，導(dǎo)致過量的NO生成，過量的NO容易引起脂質(zhì)過氧化[23]。GSH、SOD、CAT是機體抵御自由基的重要防線，在清除自由基、維持機體內(nèi)自由基平衡、防止氧化應(yīng)激和清除脂質(zhì)過氧化物積累等方面起著重要作用。組織中這些酶的活力可作為衡量抗氧化能力的指標(biāo)。研究表明順鉑可以降低大鼠肝臟、腎臟中GSH的含量，抑制SOD、CAT等酶的活力，從而使脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物積累引起機體損傷[31]。

由于蜂膠具有很好的抗氧化作用，可作為天然的抗氧化劑使用，故本實驗從抗氧化角度研究其對順鉑造成肝、腎損傷的干預(yù)作用。實驗結(jié)果表明，在腹腔注射順鉑之后，與對照組相比，順鉑可引起肝臟、腎臟的氧化損傷造成脂質(zhì)過氧化物的大量產(chǎn)生，降低體內(nèi)抗氧化酶的活力，這與Li Chengzhen[32]和Kart[33]等的實驗結(jié)論相一致。給藥蜂膠之后，肝、腎組織中MDA、iNOS較模型組有明顯的降低，GSH的含量、CAT、SOD等酶的活力均有顯著性提高，說明蜂膠可以通過降低順鉑造成的氧化損傷，從而降低順鉑對肝、腎的損傷。

綜上所述，本研究從提高機體抗氧化能力、降低體內(nèi)氧化應(yīng)激等角度，表明蜂膠可以有效地降低順鉑造成的肝、腎毒性。但是具體的作用機制還不清楚，有待于從分子角度更進一步進行研究。本研究為臨床上找到一種可以降低順鉑造成肝、腎損傷的藥物和食品，也擴寬了蜂膠的應(yīng)用范圍，為蜂膠的綜合開發(fā)利用提供了實驗依據(jù)。