鐵珊珊，劉夢(mèng)培，縱 偉*，張麗華，趙光遠(yuǎn)

（鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450002）

原花青素又稱縮合單寧，主要存在于水果和蔬菜中，例如葡萄、蘋果和洋蔥等，是人類飲食的重要組成部分[1-3]。它具有抗氧化、清除自由基、抑制低密度脂蛋白氧化、減少心肌缺血再灌注損傷等生物活性，被廣泛應(yīng)用于藥物、化妝品和食品等領(lǐng)域[4-5]。按照聚合度的大小，通常將聚合度2～4的稱為低聚原花青素，將四聚體以上的稱為高聚原花青素[6]。低聚體可以在體內(nèi)被消化吸收，而高聚體則不能，然而，產(chǎn)品中的原花青素主要為高聚體，導(dǎo)致原花青素的生物利用度極低[7-8]。

目前主要采用以下方法提高原花青素的生物利用率和產(chǎn)品附加值：1）將提取出來的原花青素進(jìn)一步分離和富集獲得低聚原花青素，主要采用樹脂吸附分離和膜分離法，但高聚體得不到有效利用[9-10]；2）將高聚原花青素降解為低聚原花青素，主要有生物降解法以及堿性降解法、芐硫醇降解法等化學(xué)方法，但反應(yīng)激烈，容易造成產(chǎn)品結(jié)構(gòu)破壞[3,11-12]。動(dòng)態(tài)高壓微射流均質(zhì)技術(shù)（dynamic high pressure microfluidization，DHPM）是一種特殊形式的物理高壓均質(zhì)技術(shù)，具有能耗低、污染少、改善多聚體結(jié)構(gòu)、不同壓力作用樣品性質(zhì)變化不同等優(yōu)點(diǎn)[13-15]。Sun Cuixia等[16]研究發(fā)現(xiàn)采用DHPM處理玉米蛋白乙醇溶液會(huì)改變玉米蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)；張博[17]研究發(fā)現(xiàn)蠟質(zhì)淀粉經(jīng)DHPM處理后分子鏈發(fā)生斷裂，分子質(zhì)量有所下降。而DHPM這一物理改性技術(shù)對(duì)原花青素性質(zhì)的影響鮮有報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)主要采用DHPM處理原花青素溶液，研究處理壓力和次數(shù)對(duì)原花青素的平均聚合度以及抗氧化性能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原花青素（純度≥98%） 山東康美藥業(yè)有限公司；兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品 天津市尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司；VC、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、鐵氰化鉀、三氯乙酸、香草醛等均為分析純 國藥集團(tuán)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FPG12800高壓納米均質(zhì)機(jī) 安盛聯(lián)合科技有限公司；XY-FD-18真空冷凍干燥機(jī) 上海欣諭儀器有限公司；T6新世紀(jì)紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

將10 g原花青素溶于蒸餾水中，定容至1 000 mL。

1.3.2 DHPM處理

采用DHPM將原花青素水溶液在不同的處理壓力（100、140、180、220 MPa和260 MPa）分別下進(jìn)行1、2、3、4 次循環(huán)處理，接著將其進(jìn)行冷凍干燥，獲得不同處理?xiàng)l件下的樣品。與未經(jīng)高壓處理的樣品（對(duì)照組）進(jìn)行比較分析。

1.3.3 原花青素平均聚合度的測(cè)定

準(zhǔn)確稱量1 mg樣品，根據(jù)彭芳剛等[18]的方法測(cè)定原花青素的平均聚合度：采用傳統(tǒng)的香草醛-甲醇法測(cè)定原花青素的質(zhì)量，以兒茶素為標(biāo)準(zhǔn)品，獲得吸光度與兒茶素質(zhì)量濃度之間的線性關(guān)系為y＝0.305 7x+0.010 1，R2＝0.998 2；采用香草醛-乙酸法測(cè)定原花青素物質(zhì)的量，吸光度與兒茶素物質(zhì)的量濃度之間的關(guān)系為y＝1.177 3x+0.028 2，R2＝0.996 9，按照下式算出原花青素的平均聚合度。

式中：m為原花青素的質(zhì)量/μg；n為原花青素物質(zhì)的量/μmol；M為單體兒茶素的摩爾質(zhì)量（290 g/moL）。

1.3.4 鐵還原力的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[19]中的方法測(cè)定原花青素的鐵還原力。

1.3.5 清除DPPH自由基能力的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[20]中的方法測(cè)定原花青素清除DPPH自由基的能力。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 8.5、SPSS軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，Duncan法分析差異顯著性，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 原花青素平均聚合度分析

聚合度是衡量原花青素的重要品質(zhì)之一[21]。圖1為100、140、180、220、260 MPa下分別進(jìn)行1、2、3、4 次循環(huán)處理前后原花青素的平均聚合度。

圖 1 處理壓力和次數(shù)對(duì)原花青素平均聚合度的影響Fig. 1 Effects of different processing pressure levels and cycles on the degree of polymerization of proanthocyanidins

由圖1可知，不同處理?xiàng)l件下原花青素的聚合度不同，未經(jīng)超高壓處理的原花青素平均聚合度為3.85，經(jīng)超高壓處理后原花青素的平均聚合度均低于2.00，兩者之間存在顯著差異（P＜0.05），可能是由于超高壓處理過程中，高聚原花青素的氫鍵等非共價(jià)鍵發(fā)生斷裂，導(dǎo)致原花青素的平均聚合度下降，該結(jié)論與梁瑞紅等[22]關(guān)于DHPM處理對(duì)低酯果膠分子質(zhì)量的影響研究結(jié)果一致。隨著處理壓力的升高，原花青素的平均聚合度之間總體不存在顯著差異，但從其數(shù)值上來看，220 MPa下原花青素的平均聚合度相對(duì)較低；壓力為100、140 MPa時(shí)，平均聚合度隨著處理次數(shù)增加呈下降趨勢(shì)，壓力為180、220 MPa時(shí)，隨著處理次數(shù)增加，平均聚合度則無明顯變化規(guī)律，但4 次處理?xiàng)l件下樣品的平均聚合度最小，260 MPa下平均聚合度呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)。處理壓力為220 MPa，次數(shù)為4條件下獲得的平均聚合度最低（1.32），顯著低于其他處理?xiàng)l件下的聚合度（P＜0.05）。

2.2 抗氧化能力分析

根據(jù)DHPM不同處理壓力和次數(shù)對(duì)原花青素平均聚合度的影響，選擇處理次數(shù)為4條件下的不同處理壓力進(jìn)行抗氧化能力分析，比較其與對(duì)照組以及VC抗氧化能力之間的差異。

2.2.1 鐵還原力分析

在食品體系中，一些過渡金屬在自由基形成的過程中可以作為催化劑，其中亞鐵離子是最有效的助氧化劑，具有極高的反應(yīng)活性。因此鐵還原力的測(cè)定通常用來評(píng)價(jià)天然抗氧化劑的供電子能力，可以反映樣品的抗氧化能力[23]。

由圖2可知，同一質(zhì)量濃度不同處理?xiàng)l件下原花青素的鐵還原能力不同，隨著質(zhì)量濃度的升高，樣品的吸光度增大，吸光度與樣品的還原力呈正相關(guān)，樣品的吸光度越大，表明其還原力越強(qiáng)[24]；在測(cè)定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)原花青素的鐵還原能力均高于VC對(duì)照品；經(jīng)高壓處理的原花青素鐵還原力均高于未經(jīng)高壓處理的原花青素。鐵還原能力順序?yàn)椋?20 MPa＞180 MPa＞140 MPa＞100 MPa＞260 MPa＞對(duì)照組＞VC。樣品質(zhì)量濃度為12.5 μg/mL和25.0 μg/mL時(shí)，處理壓力為100、140、220、260 MPa條件下的原花青素鐵還原力之間不存在顯著差異（P＞0.05）。當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為50.0、100.0 μg/mL時(shí)，100、140 MPa下獲得的原花青素鐵還原力之間不存在顯著差異（P＞0.05）；當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為75 μg/mL時(shí)，樣品之間不存在顯著性差異，但均高于VC的還原能力（P＜0.05）?？傊?，不同處理壓力下的原花青素鐵還原力存在一定差異。

2.2.2 清除DPPH自由基能力分析

DPPH自由基清除能力是當(dāng)前檢測(cè)樣品抗氧化能力使用最為廣泛的指標(biāo)，原花青素的質(zhì)量濃度和抗氧化能力與DPPH自由基清除率呈正相關(guān)[25]。

圖 3 不同處理壓力下原花青素對(duì)DPPH自由基的清除能力Fig. 3 DPPH radical scavenging capacity of proanthocyanidins at different processing pressures

由圖3可知，不同壓力下原花青素的自由基清除能力不同，在1.0～20.0 μg/mL范圍內(nèi)，對(duì)DPPH自由基清除能力呈現(xiàn)明顯的劑量依賴效應(yīng)關(guān)系，然后隨著質(zhì)量濃度的增加，DPPH自由基清除能力增速減慢；原花青素的清除能力均高于相同質(zhì)量濃度下的VC對(duì)照組；經(jīng)高壓處理的原花青素清除能力均高于相同質(zhì)量濃度下未經(jīng)高壓處理的樣品。DPPH自由基清除能力順序?yàn)椋?20 MPa＞180 MPa＞140 MPa＞100 MPa＞260 MPa＞對(duì)照組＞VC。在質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL時(shí)，處理壓力為140 MPa（清除率13.13%）、180 MPa（13.23%）、220 MPa（14.48%）條件下原花青素的DPPH自由基清除能力不存在顯著差異（P＜0.05），但220 MPa下原花青素的清除能力相對(duì)較高；質(zhì)量濃度為2.5 μg/mL時(shí)，100 MPa（23.47%）、140 MPa（23.92%）、180 MPa（23.84%）、220 MPa（23.90%）條件下原花青素的DPPH自由基清除能力不存在顯著差異（P＜0.05）；在質(zhì)量濃度為5.0、10.0、20.0 μg/mL時(shí)，100、140、180、220 MPa下原花青素的清除能力無顯著差異，但在質(zhì)量濃度為20.0 μg/mL時(shí)，220 MPa下原花青素的自由基清除能力達(dá)到90%的清除效果；在質(zhì)量濃度為40.0 μg/mL時(shí)，所有樣品的自由基清除能力均超過90%，且不存在顯著差異。

2.2.3 原花青素抗氧化能力的IC50

原花青素鐵還原力半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）為抑制率達(dá)到50%時(shí)樣品的質(zhì)量濃度[26]。

由表1可知，700 nm波長處吸光度隨原花青素質(zhì)量濃度的增加而升高，且相關(guān)系數(shù)R2值均大于0.990 0，說明還原力與原花青素質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系。根據(jù)回歸方程可以得知不同樣品的IC50，220 MPa下原花青素的鐵還原力IC50為42.7 μg/mL最小，未經(jīng)高壓處理的IC50最大為51.7 μg/mL，均小于陽性對(duì)照組VC的52.7 μg/mL，IC50越小表示樣品清除自由基能力越強(qiáng)，反之樣品清除自由基能力弱[27]；因此220 MPa下原花青素的鐵還原能力最強(qiáng)。

表 1 不同處理壓力下原花青素及VC的鐵還原力IC50Table 1 IC50 for ferrous ion chelating activity of proanthocyanidins at different processing pressures and VC

原花青素DPPH自由基清除能力IC50為清除率達(dá)到50%時(shí)所需要的抗氧化劑質(zhì)量濃度[27]。本實(shí)驗(yàn)中，原花青素DPPH自由基清除能力IC50由小到大依次為：220 MPa（6.469 μg/mL）＜180 MPa（6.929 μg/mL）＜140 MPa（7.183 μg/mL）＜100 MPa（7.481 μg/mL）＜260 MPa（7.831 μg/mL）＜對(duì)照組（7.866 μg/mL）＜VC（8.644 μg/mL）。IC50越小抗氧化能力越強(qiáng)，說明220 MPa下原花青素的抗氧化能力最強(qiáng)。

3 結(jié) 論

通過分析處理壓力和次數(shù)對(duì)原花青素平均聚合度的影響可知，DHPM處理會(huì)破壞原花青素的分子結(jié)構(gòu)，使其平均聚合度降低。隨著處理壓力的增加，原花青素的平均聚合度之間雖不存在顯著性差異，220 MPa下平均聚合度相對(duì)較?。惶幚泶螖?shù)為4條件下平均聚合度最小。

固定處理次數(shù)為4，選擇不同處理壓力的樣品進(jìn)行抗氧化能力分析，包括鐵還原力和DPPH自由基清除能力，抗氧化能力順序?yàn)椋?20 MPa＞180 MPa＞140 MPa＞100 MPa＞260 MPa＞對(duì)照組＞VC；IC50的變化趨勢(shì)完全與其相反，處理壓力為220 MPa下的原花青素抗氧化能力最強(qiáng)。說明在一定范圍內(nèi)原花青素的平均聚合度越小其抗氧化能力越強(qiáng)。