吳煥良 蘇亞靜 吳大平

(海南省儋州市人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，儋州 571700)

乳腺癌是常見的女性惡性腫瘤之一，在女性惡性腫瘤中位居第一位，具有高的發(fā)病率、強(qiáng)的侵襲性及早期就可向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等特性，給女性的生命健康造成了嚴(yán)重的威脅。目前主要的治療手段為手術(shù)輔助放化療及生物治療，但都有一定的局限性[1,2]。腫瘤的發(fā)生與基因的調(diào)控密切相關(guān)，尋找引起乳腺癌發(fā)生的分子機(jī)制對于治療具有重要意義。斯鈣素-2(Stanniocalcin-2，STC2)是一類分泌性的糖蛋白，在多種器官及組織中都有表達(dá)，參與調(diào)節(jié)多種病理及生理過程[3,4]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，STC2在胃癌、卵巢癌、肝癌等多種惡性腫瘤中表達(dá)明顯增高，雖然在腫瘤的作用機(jī)理還不清楚，但能夠在多種腫瘤上發(fā)揮促生長增殖、侵襲轉(zhuǎn)移等作用[5-7]。STC2基因?qū)θ橄侔┥飳W(xué)特性及機(jī)制研究尚未清楚。RNA干擾(RNA interference，RNAi)是由雙鏈RNA誘導(dǎo)的能使特異mRNA序列降解的現(xiàn)象，是近些年來發(fā)現(xiàn)和發(fā)展起來的基因阻斷技術(shù)，具有高效性、特異性等特點，是研究基因功能有效的途徑[8-10]。本研究首先檢測了乳腺癌細(xì)胞中STC2基因的表達(dá)，通過RNA干擾技術(shù)沉默其表達(dá)，觀察細(xì)胞增殖、周期及凋亡的變化，并進(jìn)一步研究其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1一般材料 收集儋州市人民醫(yī)院2013年6至2015年1月保存的乳腺癌組織及相應(yīng)的癌旁組織(距離癌組織5 cm以上)，各48例，年齡為24～71歲，平均年齡為47.2歲。乳腺癌組織的臨床分期按照美國癌癥研究聯(lián)合會AJCC癌癥分期手冊(第七版)TNM分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期分別為12例、26例、10例；腫瘤最大直徑≤2 cm患者21例，5 cm≥腫瘤最高直徑2 cm患者27例；病例類型：浸潤性導(dǎo)管癌、浸潤性小葉癌、浸潤性篩狀癌分別為42例、4例和2例；有淋巴結(jié)及無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者分別為22例26例?；颊咝g(shù)前均未行放療及化療。組織樣本離體后均由液氮速凍處理，置于-80℃冰箱保存。所有標(biāo)本的采集均經(jīng)過患者及家屬的知情同意。人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.1.2主要試劑和儀器 胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒、總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自大連TaKaRa；STC2、ki67、細(xì)胞周期素(cyclin D1)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3，Cleaved caspase3)、Notch1、Hes1抗體均購自美國Abcam公司；二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA)試劑盒、CCK8試劑盒、膜聯(lián)蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)/碘化丙錠(PI)試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)研究所；酶標(biāo)儀購自Bio-Rad公司；流式細(xì)胞儀購自美國Becton Dickinson公司。

1.2方法

1.2.1RT-PCR檢測乳腺癌細(xì)胞STC2基因表達(dá) 參照RNA提取試劑盒操作說明提取乳腺癌組織及相應(yīng)的癌旁組織中的總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說明反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。STC2及內(nèi)參基因GAPDH的RT-PCR引物分別為：STC2上游引物：5′-ATGCTACCTCAAGC-ACGACC-3′，下游引物：5′-TCTGCTCACACTGAACC-TGC-3′。GAPDH上游引物：5′-ATGACCCCTTCA-TTGACC-3′，下游引物：5′-GAAGATGGTGATGG-GATTTC-3′。所有引物由上海生工合成。PCR擴(kuò)增條件為：95℃ 5 min；95℃ 30 s；60℃ 15 s，72℃ 20 s，以上共40個循環(huán)。72℃延伸15 min，4℃保存。實驗數(shù)據(jù)(Ct值)采用2-ΔΔCt法進(jìn)行統(tǒng)計。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 MCF-7細(xì)胞在RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清、100 μg/ml鏈霉素和100 U/ml青霉素)中，置于37℃、5%CO2，95%飽和濕度的培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染分為Control組(無特殊處理)、NC-siRNA組(轉(zhuǎn)染不具有任何干擾作用的siRNA)、 STC2-siRNA組(轉(zhuǎn)染干擾STC2表達(dá)的siRNA)，轉(zhuǎn)染前24 h將生長至對數(shù)期的MCF-7細(xì)胞以1×106個/孔濃度每孔加入2 ml接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞生長達(dá)到80%以上融合度時，參照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染說明進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.2.3蛋白質(zhì)印跡(Western blot)檢測 提取乳腺癌組織和相應(yīng)的癌旁組織及轉(zhuǎn)染48 h的上述三組細(xì)胞中的總蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度，每泳道30 μg蛋白樣品10%的SDS-PAGE分離，電泳后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5%的脫脂奶粉溶液封閉過夜，加入一抗，4℃過夜，洗膜后加入1∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，室溫孵育1 h，增強(qiáng)型化學(xué)法(ECL)發(fā)光顯色，X線片曝光，顯影，定影。

1.2.4CCK8檢測細(xì)胞增殖 取上述轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞，每孔細(xì)胞中加入CCK8溶液10 μl，孵育2 h后酶標(biāo)儀檢測570 nm吸光度(A)，記錄結(jié)果，實驗重復(fù)3次。計算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率=(轉(zhuǎn)染組細(xì)胞A/對照組細(xì)胞A)×100%。

1.2.5流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期 收集轉(zhuǎn)染48 h的三組細(xì)胞，預(yù)冷的磷酸緩沖液洗滌細(xì)胞，0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞，細(xì)胞濃度調(diào)整為1.0×106個/ml，4℃預(yù)冷的75%乙醇固定細(xì)胞48 h，離心，棄上清，磷酸緩沖液重懸細(xì)胞，加入50 μl RNase(0.5 mg/ml)，充分混勻后37℃水浴30 min，磷酸緩沖液洗滌后重懸細(xì)胞，加入50 μl的碘化丙啶(1 mg/ml)，混勻后置于4℃條件下避光反應(yīng)30 min，流式細(xì)胞儀測定各組細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度，利用CellQuest軟件對細(xì)胞進(jìn)行DNA含量分析，確定細(xì)胞周期。

1.2.6流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 收集轉(zhuǎn)染48 h的三組細(xì)胞，預(yù)冷的磷酸緩沖液洗滌細(xì)胞，0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×106個/ml，根據(jù)Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒的操作說明檢測各組細(xì)胞的凋亡情況

2 結(jié)果

2.1乳腺癌中STC2基因的mRNA及蛋白表達(dá) 乳腺癌中STC2基因的mRNA及蛋白表達(dá)結(jié)果如圖1 所示，乳腺癌及癌旁組織中STC2基因的mRNA表達(dá)分別為5.543±1.039、0.898±0.156，在癌旁組織的蛋白表達(dá)分別為0.095±0.010、0.112±0.012、0.106±0.011、0.083±0.009、0.110±0.012、0.134±0.013，乳腺癌組織的蛋白表達(dá)分別為0.653±0.053、0.722±0.059、0.694±0.063、0.564±0.049、0. 454±0.039、 0. 645±0.058。 STC2基因在乳腺癌中的mRNA及蛋白表達(dá)均顯著高于癌旁組織(tmRNA=7.658，PmRNA=0.002；t1=17.919，P1=0.000；t2=17.548，P2=0.000；t3=15.925，P3=0.000；t4=16.723，P4=0.000；t5=14.602，P5=0.000；t6=14.891，P6=0.000)。

圖1 乳腺癌中STC2基因的mRNA及蛋白表達(dá)Fig.1 mRNA and protein expression of STC2 gene in breast cancerNote:A.mRNA expression of STC2 gene in breast cancer,compared with paracancerous tissues,*.P<0.05;B.Protein expression of STC2 gene in breast cancer.

2.2STC2基因的表達(dá)與乳腺癌病理特征的關(guān)系 由表1可知，STC2基因的表達(dá)與乳腺癌患者年齡、組織學(xué)分級及是否發(fā)生轉(zhuǎn)移無關(guān)(P>0.05)，與病理分期、腫瘤大小相關(guān)(P<0.05)。

2.3抑制STC2基因表達(dá)的效果 Control組、NC-siRNA組及STC2-siRNA組STC2的蛋白表達(dá)分別為0.611±0.052、0.577±0.048、0.094±0.011，三組STC2的蛋白表達(dá)差異顯著有統(tǒng)計學(xué)意義(F=141.716，P=0.000)，NC-siRNA組STC2的蛋白表達(dá)與 Control組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，STC2-siRNA組STC2的蛋白表達(dá)顯著低于Control組(t=15.314，P=0.000)。見圖2。

2.4抑制STC2基因表達(dá)降低乳腺癌細(xì)胞增殖 Control組、NC-siRNA組及STC2-siRNA組細(xì)胞存活率分別為(100.00±2.46)%、(94.18±3.12)%、(65.55±4.36)%，細(xì)胞存活率在三組的差異顯著(F=87.957,P=0.000),STC2-siRNA組細(xì)胞存活率降低，與Control組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=12.389，P=0.000)。見圖3。

表1STC2基因的表達(dá)與乳腺癌病理特征的關(guān)系

Tab.1RelationshipbetweenexpressionofSTC2geneandpathologicalfeaturesofbreastcancer

Clinical parametersnSTC2 mRNA expressionLow(-)High(+)χ2PAge0.004>0.05≤50207(35.0%)13(65.0%)>50288(28.6%)20(71.4%)Pathological staging6.646<0.05Ⅰ126(50.0%)6(50.0%)Ⅱ263(11.5%)23(88.5%)Ⅲ103(30.0%)7(70.0%)Tumor size4.148<0.05≤2 cm217(33.3%)14(66.7)5 cm≥T>2 cm2717(63.0%)10(37.0%)Grade0.190>0.05Ⅰ127(58.3%)5(41.7%)Ⅱ2111(52.4%)10(47.6%)Ⅲ147(50.0%)7(50.0%)Lymph node metastasis0.001>0.05Yes2110(47.6%)11(52.4%)No2713(48.1%)14(51.9%)

2.5抑制STC2基因表達(dá)阻滯乳腺癌細(xì)胞周期 細(xì)胞周期檢測結(jié)果見圖4、表2，STC2-siRNA組G0/G1期細(xì)胞升高，S期和G2/M細(xì)胞降低，與Control組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(tG0/G1=5.081，PG0/G1=0.007；tS=12.136，PS=0.000；tG2/M=10.613，PG2/M=0.000)。

2.6抑制STC2基因表達(dá)誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡 Control組、NC-siRNA組及STC2-siRNA組細(xì)胞凋亡率分別為(1.51±0.42)%、(1.53±0.45)%、(18.68±1.14)%，三組整體比較差異顯著(F=526.302,P=0.000)，STC2-siRNA組細(xì)胞凋亡率升高，與Control組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=28.114，P=0.000)。見圖5。

2.7抑制STC2基因?qū)θ橄侔┘?xì)胞ki67、cyclin D1、Cleaved caspase3表達(dá)的影響 Western blot檢測增殖相關(guān)蛋白ki67、周期相關(guān)蛋白cyclin D1及凋亡相關(guān)蛋白Cleaved caspase3的蛋白表達(dá)，結(jié)果如圖6所示， Control組、 NC-siRNA組及STC2-siRNA組ki67的蛋白表達(dá)分別為0.667±0.048、0.682±0.046、0.252±0.039，cyclin D1的蛋白表達(dá)分別為0.271±0.029、0.283±0.027、0.174±0.022，Cleaved caspase3的蛋白表達(dá)分別為0.032±0.009、0.030±0.010、0.131±0.015，ki67、cyclin D1和Cleaved caspase3的蛋白表達(dá)在三組中差異顯著有統(tǒng)計學(xué)意義(Fki67=90.225,Pki67=0.000,Fcyclin D1=15.653,Pcyclin D1=0.004,FCleaved caspase3=73.914,PCleaved caspase3=0.000)，STC2-siRNA組ki67、cyclin D1表達(dá)降低，Cleaved caspase3表達(dá)升高，與Control組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(tki67=11.422，Pki67=0.000；tcyclin D1=4.540，Pcyclin D1=0.004；tCleaved caspase3=10.423，PCleaved caspase3=0.000)。

圖2 抑制STC2基因表達(dá)的效果Fig.2 Effect of expression of STC2 gene was inhibitedNote:A.Western blot was used to detect the expression of STC2 protein;B.The relative expression of STC2 protein;compared with control group,*.P<0.05.

圖3 抑制STC2基因表達(dá)后乳腺癌細(xì)胞增殖情況Fig.3 Proliferation of breast cancer cells after expression of STC2 gene was inhibitedNote:Compared with control,*.P<0.05.

表2抑制STC2基因表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞周期情況

Tab.2CycleofbreastcancercellsafterexpressionofSTC2genewasinhibited

GroupsCell cycle changeG0/G1(%)S(%)G2/M(%)Control group59.14±4.02 26.83±1.2114.03±1.30NC-siRNA group58.88±4.6227.46±1.7813.66±1.26STC2-siRNA group78.26±5.131) 16.18±0.921)5.56±0.471)F17.42165.99658.949P<0.01<0.01<0.01

Note：Compared with control,1)P<0.05.

圖4 抑制STC2基因表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞周期的影響Fig.4 Influence of inhibiting of STC2 gene expression on breast cancer cell cycle

圖5 抑制STC2基因表達(dá)后乳腺癌細(xì)胞凋亡情況Fig.5 Apoptosis of breast cancer cells after expression of STC2 gene was inhibitedNote:A.Flow cytometry results;B.Apoptosis rate of each group;compared with control,*.P<0.05.

圖6 抑制STC2基因?qū)θ橄侔┘?xì)胞ki67、cyclin D1、Cleaved caspase3表達(dá)的影響Fig.6 Expression of ki67,cyclin D1,Cleaved caspase3 in breast cancer cells after expression of STC2 gene was inhibitedNote:A.Western blot test result diagram;B.The relative expression of protein;compared with control,*.P<0.05.

圖7 抑制STC2基因?qū)θ橄侔┘?xì)胞Notch1信號通路的影響Fig.7 Effects of Notch1 signaling pathway in breast cancer cells after expression of STC2 gene was inhibitedNote:A.Western blot test result diagram;B.The relative expression of protein;compared with control,*.P<0.05.

2.8抑制STC2基因下調(diào)乳腺癌細(xì)胞Notch1信號通路 Control組、NC-siRNA組及STC2-siRNA組Notch1的蛋白表達(dá)分別為0.711±0.054、0.720±0.053、0.102±0.021，Hes1的蛋白表達(dá)分別為0.238±0.031、0.239±0.036、0.086±0.010，Notch1、Hes1的蛋白表達(dá)在三組中差異顯著(FNotch1=183.154,PNotch1=0.000,FHes1=29.602,PHes1=0.001)，STC2-siRNA組Notch1、Hes1蛋白均下調(diào)表達(dá)，與Control組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(tNotch1=16.452，PNotch1=0.000；tHes1=6.642，PHes1=0.001)。見圖7。

3 討論

近些年我國乳腺癌的發(fā)病率、復(fù)發(fā)率有逐年上升的趨勢，嚴(yán)重危害女性的生命健康，手術(shù)、放化療及生物治療輔助是主要的治療手段，但有一定的局限性[11,12]。乳腺癌的發(fā)生是由多種基因共同參與的復(fù)雜過程，目前已發(fā)現(xiàn)多個與乳腺癌發(fā)生相關(guān)的基因，尋找新的影響乳腺癌發(fā)生的基因，并研究其作用對于乳腺癌預(yù)防、診斷及治療具有重要意義。STC2是STC家族中的一員，屬于糖蛋白類激素，廣泛分布于人體的組織器官，在脾臟、胰腺、骨骼肌和腎臟的含量較高，除了具有鈣磷代謝調(diào)節(jié)作用外，還調(diào)控骨骼發(fā)育、氧化應(yīng)激、血管生成等多種生理病理過程[13-15]。此外，多項研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤組織中有STC2基因的異常表達(dá)[16-20]。肝癌細(xì)胞系中STC2能夠促進(jìn)增殖及增殖相關(guān)基因的表達(dá)，并能影響肝癌細(xì)胞的EMT過程，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移[21]。宮頸癌中STC2的表達(dá)明顯高于正常組織，其表達(dá)能促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[22,23]。

本研究檢測到乳腺癌組織中STC2基因存在高表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其與病理分期、腫瘤大小相關(guān)，通過RNA干擾技術(shù)沉默其表達(dá)，結(jié)果顯示，細(xì)胞增殖顯著降低、凋亡增加，且細(xì)胞被阻滯在G1期，ki67、Cyclin D1蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，Cleaved caspase3蛋白表達(dá)顯著上調(diào)。腫瘤增殖抗原ki67定位于人類基因10q25，是反映細(xì)胞增殖的核抗原，參與多種腫瘤細(xì)胞的生長、發(fā)展及預(yù)后等過程，是檢測細(xì)胞增殖活性的關(guān)鍵指標(biāo)，可以客觀地標(biāo)記腫瘤的增殖能力，目前已在多種腫瘤中得到研究[24-27]。Cyclin D1是細(xì)胞周期蛋白，是G1期細(xì)胞周期素，主要促進(jìn)細(xì)胞通過G1/S檢查點，作為在腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過程中正調(diào)控細(xì)胞周期的重要因子發(fā)揮作用，目前已在多種腫瘤中被證實是檢測預(yù)后的重要指標(biāo)[28，29]。凋亡發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是Caspase的激活，Caspase3是Caspase家族的關(guān)鍵酶，處在Caspase級聯(lián)反應(yīng)的下游，是細(xì)胞在接受各種凋亡信號的共同通路，其活性將使凋亡進(jìn)入不可逆階段，在肺癌、乳腺癌、肝癌等多種腫瘤中均得到證實[30-32]。

Notch信號通路是一條古老而保守的信號通路，參與細(xì)胞的增殖、凋亡、分化、黏附、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等過程[33]。有研究顯示，在多種腫瘤中，如乳腺癌、肺癌、腦膠質(zhì)瘤等有異常表達(dá)，其表達(dá)影響腫瘤的發(fā)生及發(fā)展[34-36]。Notch1為Notch信號通路的一個受體，其表達(dá)也與多種腫瘤發(fā)生有關(guān)[37,38]。乳腺癌細(xì)胞中抑制Notch1信號通路可降低癌細(xì)胞的發(fā)展進(jìn)程[39]。Hes1是Notch1信號通路最重要的靶基因，其表達(dá)是Notch1信號通路是否激活的重要標(biāo)志。本研究檢測抑制STC2基因表達(dá)后乳腺癌細(xì)胞中Notch1、Hes1的蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，Notch1、Hes1蛋白均顯著下調(diào)表達(dá)。

綜上所述，STC2基因在乳腺癌組織中高表達(dá)，其表達(dá)與病理分期、腫瘤大小相關(guān)，RNA干擾沉默其表達(dá)后可降低癌細(xì)胞的增殖，阻滯細(xì)胞于G1期，并促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。本研究提示STC2基因在乳腺癌的發(fā)生及發(fā)展中有重要作用，可作為一種分子標(biāo)志物及治療靶點用于診斷和治療。