任翠翠 ，周云云 ，李高彪 ，李雨薇 ，艾華 ，雷曉琴

糖尿病性視網(wǎng)膜病變（Diabetic retinopathy，DR）是糖尿病（diabetes mellitus，DM）最常見、最具破壞性的微血管病變，是臨床常見的致盲性眼病之一。預(yù)計到2030年，全球DR的發(fā)病人數(shù)上升到1.9億[1-3]。增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變 （proliferative diabetic retinopathy，PDR）是DR發(fā)展的一個嚴(yán)重階段，以形成新生血管為主要特點，血管內(nèi)皮生長因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF） 是主要的促血管增生因子[4]?？剐律艿纳蓪DR的治療至關(guān)重要[5-6]。通絡(luò)駐景丸是在駐景丸的基礎(chǔ)上由雷曉琴教授優(yōu)化而成，對DR療效確切[7]，并進(jìn)行了深入的相關(guān)實驗研究[8-9]。因此，本實驗進(jìn)一步從抗VEGF角度，探討通絡(luò)駐景丸干預(yù)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變的作用機(jī)制，為該方的臨床應(yīng)用和進(jìn)一步研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

雄性SD健康大鼠，體重180~220 g，購于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心，許可證號：SCXK（陜）2014-003。

1.2 試劑與藥物

通絡(luò)駐景丸（組成：熟地、菟絲子、車前子、三七、蒲黃、砂仁、地龍等），規(guī)格 10 粒/g，批號：20160406，西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院提供。鏈脲佐菌素（CAS：18883-66-4，Sigma， 美國）；DAB 顯色試劑盒（博士德生物技術(shù)有限公司，武漢）。兔抗小鼠VEGF單克隆抗體（中山生物技術(shù)有限公司，中山），VEGF ELISA 試劑盒（RapidBio，CA）等。

1.3 實驗儀器

羅氏血糖儀和卓越金銳血糖試紙 （羅氏診斷有限公司，德國），Olympus BX51-DP71顯微鏡（Olympus，日本），電子天平（民橋精密科學(xué)儀器有限公司，上海）。

1.4 造模和分組

健康雄性SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，隨機(jī)選取15只為空白對照組 （NC組），其余大鼠腹腔注射STZ造模。按1%STZ溶解于新鮮配制的檸檬酸緩沖液中，60 mg/kg體質(zhì)量腹腔注射誘發(fā)糖尿病。NC組按60 mg/kg體質(zhì)量腹腔注射檸檬酸緩沖液。整個過程無菌操作，10 min內(nèi)完成。注射后30 min恢復(fù)進(jìn)食。72 h后大鼠尾靜脈采血測量血糖，剔除隨機(jī)血糖低于16.7 mmol/L的大鼠。取造模成功的大鼠隨機(jī)分為4組：模型組（DM組），通絡(luò)駐景丸低、中、高劑量組（TLP-L組、TLP-M組、TLP-H組），每組15只。DM和NC組給予蒸餾水，TLP-L、TLP-M和TLP-H組分別按照通絡(luò)駐景丸1.65 g生藥/kg、3.33 g生藥/kg、6.66 g生藥/kg灌胃給藥，給藥容積2 ml/100 g體質(zhì)量。每日灌胃一次，連續(xù)12周。

2 實驗方法

2.1 血清中VEGF水平測定

末次給藥1 h后，腹主動脈取血，室溫靜置2 h后3500 r/min離心分離血清，使用ELISA試劑盒測定血清中VEGF含量表達(dá)。具體步驟按照VEGF試劑盒說明書進(jìn)行。

2.2 視網(wǎng)膜內(nèi)VEGF mRNA表達(dá)檢測

腹主動脈取血后，立即摘取眼球，一半眼球剝離視網(wǎng)膜后置-80℃冰箱保存，另一半用于免疫組化實驗。采用熒光實時定量PCR法測定大鼠視網(wǎng)膜組織內(nèi)VEGF mRNA表達(dá)的影響。VEGF mRNA表達(dá)以β-actin為內(nèi)標(biāo)來測算。引物序列見表1。

表1 Real-time-PCR引物序列

2.3 視網(wǎng)膜VEGF免疫組化檢測

取上述2.2中的眼球，置多聚甲醛溶液中固定12 h，剝?nèi)∫暰W(wǎng)膜，用于免疫組化實驗。用SABC免疫組織化學(xué)染色試劑盒檢測，具體操作步驟：①脫蠟和水化；②1份3%H2O2加蒸餾水10份混合，滴加在切片上，室溫靜置10 min；③抗原修復(fù)；④滴加5%BSA封閉液；⑤滴加一抗Anti-VEGF，4℃過夜；⑥滴加生物素化山羊抗小鼠IgG；⑦滴加試劑SABC；⑧DAB顯色；⑨蘇木精復(fù)染，脫水、透明、封片、鏡檢。通過圖象分析系統(tǒng)進(jìn)行量化分析。

2.4 統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析，各組數(shù)據(jù)均為計量資料，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），若p＜0.05，則認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 血清中VEGF水平

與空白組相比，模型組中大鼠血清VEGF水平顯著升高（p＜0.01），而給予不同劑量的通絡(luò)駐景丸干預(yù)后，VEGF水平均有不同程度下降，其中，通絡(luò)駐景丸高、中劑量組降幅最大（p＜0.01），見圖 1。

圖1 通絡(luò)駐景丸對糖尿病大鼠血清VEGF水平的影響

3.2 視網(wǎng)膜VEGF mRNA表達(dá)水平

與空白組相比，模型組大鼠視網(wǎng)膜VEGF mRNA的表達(dá)顯著升高（p＜0.01）。與模型組相比，不同劑量通絡(luò)駐景丸組VEGF mRNA均有不同程度的降低，且通絡(luò)駐景丸高、中劑量組降幅顯著（p＜0.01），見圖2。

圖2 通絡(luò)駐景丸對DR大鼠視網(wǎng)膜VEGF mRNA表達(dá)水平的影響

3.3 視網(wǎng)膜VEGF免疫組化

經(jīng)免疫組化染色后，糖尿病大鼠視網(wǎng)膜上VEGF陽性表達(dá)呈現(xiàn)出深棕褐色著色顆粒?？瞻捉M主要在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層中有弱的VEGF表達(dá)。與空白組相比，模型組在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)叢狀層及內(nèi)核層外核層都有VEGF的較強(qiáng)表達(dá)（p＜0.01）。與模型組相比，通絡(luò)駐景丸低劑量組VEGF的表達(dá)減弱（p＜0.05），通絡(luò)駐景丸中、高劑量組表達(dá)減弱更顯著（p＜0.01），提示通絡(luò)駐景丸可減少糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中VEGF的表達(dá)，見圖3。

圖3 DR大鼠視網(wǎng)膜VEGF免疫組化結(jié)果

4 討論

PDR是一種以眼底視網(wǎng)膜新生血管形成為主要標(biāo)志的糖尿病微血管并發(fā)癥之一[10]。通常，DR被認(rèn)為是一種細(xì)胞增殖性疾病，它的發(fā)生、發(fā)展和細(xì)胞的激活與增殖調(diào)控密切相關(guān)，新生血管本身也是細(xì)胞異常增殖的一種結(jié)果[11-12]。在眾多血管生長因子中，VEGF是目前公認(rèn)的最主要的促血管生長因子。研究認(rèn)為，視網(wǎng)膜多種細(xì)胞，包括視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞、Müller細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞都能夠產(chǎn)生VEGF[13-14]。正常生理狀態(tài)下，視網(wǎng)膜內(nèi)VEGF保持在較低的水平[15]。當(dāng)機(jī)體維持在長期高血糖狀態(tài)時，視網(wǎng)膜組織出現(xiàn)缺血缺氧，進(jìn)一步激活VEGF的表達(dá)，從而引起內(nèi)皮細(xì)胞增殖、血管管腔狹窄和閉塞、血流動力學(xué)改變，最終導(dǎo)致新生血管形成，DR病程不斷惡化[16]。研究表明，糖尿病大鼠VEGF水平的降低可使增殖性糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變得到明顯改善[17]。

中醫(yī)認(rèn)為，DR病機(jī)多為氣血陰陽失調(diào)，以氣陰兩虛、肝腎不足、陰陽兩虛為本，脈絡(luò)瘀阻、痰濁凝滯為標(biāo)。通絡(luò)駐景丸源于中醫(yī)經(jīng)典古方駐景丸，雷曉琴教授基于對駐景丸、加減駐景丸、駐景丸加減方的深入研究、臨床應(yīng)用和動物實驗的不斷探索總結(jié)的基礎(chǔ)上，創(chuàng)制形成通絡(luò)駐景丸[18]。通絡(luò)駐景丸具有滋陰活血、化瘀止血、通絡(luò)明目之效，方中熟地黃、菟絲子滋陰補(bǔ)腎、養(yǎng)肝明目，車前子清虛熱而明目，三七、蒲黃活血化瘀，墨旱蓮滋補(bǔ)肝腎、涼血止血，砂仁化濕行氣，地龍通經(jīng)入絡(luò)。諸藥合用，共成滋補(bǔ)肝腎，化瘀止血之功，具有穩(wěn)定血管內(nèi)環(huán)境，發(fā)揮減輕DR病癥的作用[19]。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，通絡(luò)駐景丸可有效減輕DM大鼠視網(wǎng)膜組織氧化應(yīng)激損傷、抑制視網(wǎng)膜增殖，這一機(jī)制可能與Nrf2/ARE通路的激活以及Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)有關(guān)[20]。本實驗在前期研究基礎(chǔ)上，通過鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)大鼠糖尿病視網(wǎng)膜病變，進(jìn)一步探討通絡(luò)駐景丸干預(yù)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜VEGF表達(dá)的作用。結(jié)果顯示，通絡(luò)駐景丸干預(yù)12周后，大鼠血清中VEGF水平均顯示不同程度的降低，且在視網(wǎng)膜組織中，VEGF mRNA和VEGF蛋白表達(dá)也顯著降低，這種降低趨勢呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系，其中以高劑量組最為顯著。提示通絡(luò)駐景丸可以降低糖尿病大鼠血清和視網(wǎng)膜組織中VEGF水平，從而發(fā)揮抵抗新生血管生成的作用，延緩DR的病程的發(fā)展。

綜上所述，本實驗初步研究表明通絡(luò)駐景丸能夠在mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中VEGF水平，發(fā)揮抗新生血管作用，為通絡(luò)駐景丸進(jìn)一步應(yīng)用與臨床治療提供實驗依據(jù)。