張瑞堂，張紅梅，金永新，馬肖，康玉龍，田新華

(甘肅省第二人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000)

溫經(jīng)止痛巴布膏系由祖師麻、白芍、懷牛膝、透骨草等十七味中藥組成，其中祖師麻、白芍為君藥，該藥處方為甘肅省第二人民醫(yī)院中醫(yī)科經(jīng)驗方，臨床使用多年，具有溫經(jīng)散寒、活血化瘀、消腫止痛之功效，在治療腰椎肩盤突出癥和腰肌勞損癥等方面具有較好療效。據(jù)文獻報道[1-2]，祖師麻(DaphnsgiraldiiNitsche.)中含有祖師麻甲素、7-羥基香豆素等活性成分，芍藥苷是毛根科植物芍藥(PaeonialactifloraPall.)的活性成分之一[3]。二藥的活性成分都具有鎮(zhèn)痛、抗炎的功能[4-6]。筆者選取該處方中君藥祖師麻和白芍中的活性成分7-羥基香豆素、芍藥苷及干浸膏得率為考察指標，采用正交試驗法優(yōu)化乙醇提取工藝，為保證其臨床用藥安全有效性、工業(yè)生產(chǎn)及質(zhì)量穩(wěn)定性提供科學依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1120高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；ALC-210.4型萬分之一電子分析天平(德國賽多利斯公司)；CP225D 型十萬分之一電子分析天平(德國賽多利斯公司)；RE52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；JY2002型百分之一電子分析天平(上海精密科學儀器有限公司)；SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水式真空泵(天津華鑫儀器廠)；HH-S26S型數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市大地自動化儀器廠)；B1210E-MT型超聲波儀(美國Branson公司，功率80 W，頻率50～60 Hz)；RX-95型熱空氣消毒箱(連云港市醫(yī)療設(shè)備廠)。

1.2 試藥

祖師麻、白芍、懷牛膝、透骨草等處方藥材均購于蘭州復興厚藥業(yè)有限公司，均符合《中國藥典》2015年版一部要求。7-羥基香豆素對照品(批號：111739-200501，供含量測定用)和芍藥苷對照品(批號：110736-200731，含量以97.9%計算，供含量測定用)均購于中國食品藥品檢定研究院。甲醇(色譜純，天津市光復精細化工研究所)，水為純化水(自制)，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗設(shè)計

選擇影響工藝的主要因素料液比、乙醇濃度、提取時間為考察因素，以7-羥基香豆素、芍藥苷、干膏得率的綜合評分為考察指標，每個因素各選擇3個水平，按照L9(34)正交試驗進行優(yōu)化，因素水平表見表1。

表1 因素水平表

2.2 試驗方法

根據(jù)因素水平，按處方比例稱取1/10的處方量藥材，按L9(34)正交表安排試驗，得提取液，濾過，其濾液濃縮、甲醇定容至一定體積V，吸取1/10 V體積的濾液，0.45 μm濾膜過濾，得到1～9號樣品溶液備用。

2.2.1 浸膏得率的測定

按上述設(shè)定方案進行提取，得提取液，趁熱過濾，濾液濃縮、甲醇定容至一定體積V，取1/10 V體積的濾液置于蒸發(fā)皿中水浴蒸干，105℃烘至質(zhì)量恒定，置干燥器中冷卻1 h，精密稱取重量，計算浸膏得率。

2.2.2 含量測定

2.2.2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm，菲羅門公司)；流動相：甲醇∶水(38∶62)；流速：0.8 mL/min；7-羥基香豆素檢測波長：294 nm，芍藥苷檢測波長：230 nm；進樣量：20 μL；柱溫：室溫。

2.2.2.2 對照品溶液的制備

精密稱取7-羥基香豆素對照品1.1 mg、芍藥苷對照品1.5 mg，分別置10 mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，分別配制成每1 mL含7-羥基香豆素0.11 mg，芍藥苷0.15 mg的對照品溶液，置于4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2.3 供試品溶液的制備

按處方比列稱取祖師麻、白芍、懷牛膝、透骨草等全部處方中藥飲片。按正交試驗設(shè)計方法進行提取后，過濾，濾液甲醇定容至100 mL容量瓶中，取10 mL定溶液用 0.45 μm濾膜過濾，濾液作為供試品溶液。

2.2.2.4 陰性對照溶液的制備

分別按處方量稱取除祖師麻外的其他中藥飲片和除白芍外的其他中藥飲片，并按“2.2.2.3”項制備祖師麻陰性對照溶液和白芍陰性對照溶液。

2.2.2.5 系統(tǒng)適用性試驗

精密吸取供試品溶液、7-羥基香豆素對照品溶液、芍藥苷對照品溶液、祖師麻陰性對照溶液、白芍陰性對照溶液各20 μL，注入高效液相色譜儀分析，按“2.2.2.1”項色譜條件進行分析。結(jié)果表明，供試品溶液中有與7-羥基香豆素、芍藥苷色譜峰保留時間一致的峰；7-羥基香豆素、芍藥苷保留時間分別為16.1 min和10.3 min；祖師麻、白芍陰性對照無干擾；7-羥基香豆素、芍藥苷理論塔板數(shù)N>3000，分離度大于1.5。7-羥基香豆素色譜圖見圖1，芍藥苷色譜圖見圖2。

圖1 7-羥基香豆素HPLC圖A.對照品；B.樣品；C.陰性對照；1.7-羥基香豆素

圖2 芍藥苷HPLC圖A.對照品；B.樣品；C.陰性對照；1.芍藥苷

2.2.2.6 線性關(guān)系考察

分別精密吸取7-羥基香豆素對照品溶液和芍藥苷對照品溶液各50，100，200，300，400，500 μL，用甲醇定容至1 mL，依次吸取上述溶液20 μL，注入高效液相色譜儀按“2.2.2.1”項色譜條件進行分析，以進樣量為橫坐標(X)，色譜峰面積為縱坐標(Y)，繪制標準線性回歸曲線，得7-羥基香豆素和芍藥苷線性回歸方程分別為Y=1×10-7X-0.001 4，r=0.999 8；Y=2×10-7X+0.025，r=0.999 2。結(jié)果表明，7-羥基香豆素和芍藥苷分別在0.11 ～1.1 μg和0.15 ～1.5 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.2.7 精密度試驗

精密吸取供試品溶液20 μL，重復進樣5次，注入高效液相色譜儀按“2.2.2.1”項色譜條件進行分析，計算得7-羥基香豆素和芍藥苷色譜峰峰面積的RSD分別為2.54%(n=5)和2.82%(n=5)；結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.2.2.8 穩(wěn)定性試驗

分別吸取20 μL供試品溶液于0，2，4，6，8，10，12，24 h注入高效液相色譜儀進行分析測定， 7-羥基香豆素和芍藥苷色譜峰峰面積的RSD分別為2.48%和2.68%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定良好。

2.2.2.9 重復性試驗

按處方比例精密稱取各味藥5份，分別加熱回流提取，按“2.2.2.3”項下操作制備供試品溶液，注入高效液相色譜儀按“2.2.2.1”項色譜條件進樣測定，依法測得7-羥基香豆素的平均含量為0.56 mg/g，RSD為2.86%(n=5)；芍藥苷的平均含量為12.23 mg/g，RSD為2.48%(n=5)。結(jié)果表明該試驗方法重復性良好。

2.2.2.10 加樣回收率試驗

按比例稱取1/10處方量的各味藥材9份，分別按已知含量的80%、100%、120%加入一定量的7-羥基香豆素對照品和芍藥苷對照品，按“2.2.2.3”項下方法制備供試溶液進行測定，結(jié)果顯示7-羥基香豆素和芍藥苷的加樣回收率分別為100.18%和99.79%；RSD分別為2.19%和2.12%。結(jié)果見表2。

2.3 正交試驗

分別精密吸取9份供試品溶液各20 μL，按“2.2.2.1”項下色譜條件，進樣測定正交試驗結(jié)果見表3。

表2 加樣回收率試驗(n=9)

表3 正交試驗結(jié)果

注：綜合評分=7-羥基香豆素含量×40%+芍藥苷含量×40%+干浸膏得率×20%

2.4 結(jié)果分析

以浸膏得率和7-羥基香豆素和芍藥苷的含量為考察指標，為從整體上評價各因素對各考察指標的影響，故選擇對各指標測定結(jié)果進行權(quán)重處理。由于浸膏得率是控制提取工藝的一種有效的量化指標，本試驗采用綜合評分的計算方法，在水提工藝優(yōu)化的評價指標中對上述4個指標的變化進行綜合考察。設(shè)定綜合評分滿分為1.0，具體分布確定為浸膏得率×0.2+7-羥基香豆素×0.4+芍藥苷×0.4，在此基礎(chǔ)上算綜合評分，方差分析見表4。

表4 方差分析表

注：F0.05(2,2)=19.00，F(xiàn)0.01(2,2)=99.00，*顯著性，**極顯著性

根據(jù)綜合評分的極差 R值及直觀分析，影響提取工藝的因素依次為提取時間、料液比、乙醇濃度；綜合方差分析結(jié)果，提取時間具有顯著性差異，其他影響因素無顯著性差異；從實驗數(shù)據(jù)和結(jié)合實際生產(chǎn)和節(jié)約成本及最大限度提出有效物質(zhì)的前提下，得出最佳工藝條件為A1B2C2。最終確定的最佳提取工藝為，加6倍量的60%乙醇，浸泡30 min，提取60 min，提取2次。

2.5 驗證試驗

稱取處方量中藥飲片各5份，按正交試驗確定的最優(yōu)條件進行驗證性試驗，由驗證試驗可知：7-羥基香豆素、芍藥苷和干浸膏得率的RSD分別為2.26%、1.62%和1.09%，結(jié)果表明，所優(yōu)選的提取條件穩(wěn)定，可行，重復性好。結(jié)果見表5。

表5 驗證試驗結(jié)果(n=5)

3 討論

3.1 單因素試驗條件考察

在經(jīng)單因素試驗考察提取次數(shù)時，考察提取了3次，經(jīng)計算得7-羥基香豆素含量分別為：0.52 mg/g、0.17 mg/g、0.01 mg/g；芍藥苷含量分別為：10.18 mg/g、1.72 mg/g、0.03 mg/g；干浸膏得率分別為15.20%、4.65%、0.31%。提取2次后三者檢測成分的提取率均可達到98%以上，考慮到制劑車間生產(chǎn)的實際情況，因此最終將正交試驗提取次數(shù)確定為2次，未將提取次數(shù)作為正交試驗考察因素。

3.2 檢測成分考察

在HPLC預試驗中曾試圖以祖師麻甲素、7-羥基香豆素、芍藥苷為檢測指標性成分，但其祖師麻甲素目標峰一直無法與干擾成分分離，而7-羥基香豆素和芍藥苷可以與其他成分分離，峰形對稱、有較好的分離度，且7-羥基香豆素、祖師麻甲素等成分都屬于香豆素類化學成分[7]，都具有鎮(zhèn)痛、抗炎作用[6]，故最終選擇7-羥基香豆素、芍藥苷為檢測指標性成分。

3.3 正交試驗結(jié)果

從正交試驗結(jié)果綜合評分直觀分析乙醇濃度應該選擇80%乙醇，但考慮到乙醇濃度無顯著性差異(P>0.05)和工業(yè)生產(chǎn)經(jīng)濟性、安全性，故最終選擇乙醇的濃度為60%。正交試驗優(yōu)化的提取條件為6倍量的60%乙醇，浸泡30 min，提取60 min，提取2次。