劉凱新，韓東衛(wèi)，朱蕾，葛鵬玲

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

目前糖尿病(Diabetes mellitus，DM)已經(jīng)成為嚴(yán)重危害我國(guó)人民健康的重要慢性非傳染性疾病之一[1]。糖尿病是由于胰島素分泌絕對(duì)或相對(duì)不足(胰島素分泌缺陷)，及機(jī)體靶組織或靶器官對(duì)胰島素敏感性的降低，導(dǎo)致的以血糖水平升高，或伴有以血脂異常等特征的代謝性疾病[2]。主要為4種類型，1型、2型、妊娠糖尿病與其他類型糖尿病，其中大于90%患者是2型糖尿病。花旗澤仁由西洋參、薏苡仁和澤瀉等中藥組成，是臨床治療2型糖尿病胰島素抵抗的經(jīng)驗(yàn)方。臨床療效證實(shí)，花旗澤仁治療脾虛濕盛，濕熱內(nèi)蘊(yùn)型糖尿病胰島素抵抗及相關(guān)疾病效果顯著[3]。為完善花旗澤仁成藥性評(píng)價(jià)，本研究選擇西洋參活性部位中含量較高，且藥理活性已被證實(shí)的化學(xué)成分20(R)人參皂苷Rb1，作為藥代動(dòng)力學(xué)檢測(cè)的指標(biāo)性成分。

人參皂苷Rb1為西洋參的主要有效成分之一，Yang等[4]研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rb1能夠改善血糖水平。Vladimir Vuksan等[5]研究發(fā)現(xiàn)西洋參能夠降低餐后血糖，并改善糖尿病代謝水平。Xie等[6]從西洋參果中分離提取多糖部分，發(fā)現(xiàn)西洋參中多糖成分具有降血糖作用。實(shí)驗(yàn)表明西洋參具有降血脂的藥理作用[7]。以上均為西洋參對(duì)2型糖尿病的預(yù)防治療提供重要的參考意義。本文研究配伍前后西洋參中活性成分人參皂苷Rb1在大鼠血漿中的比較藥代動(dòng)力學(xué)特征，完善花旗澤仁成藥性評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

液相色譜/四級(jí)桿-飛行時(shí)間串聯(lián)液質(zhì)聯(lián)用儀，美國(guó)Agilent公司；VORTEX-GENIE 2渦旋混合儀，美國(guó)Scientific公司；Centrifuge 5417R低溫高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf AG公司；SB-100 DT超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；Sartorius BSA224S-CW電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；氮吹儀，上海允延儀器有限公司。

1.2 藥品與試劑

西洋參、澤瀉、薏苡仁購(gòu)買于黑龍江省世一堂中藥飲片廠；人參皂苷Rb1標(biāo)準(zhǔn)品，成都MUST生物技術(shù)有限公司；地西泮標(biāo)準(zhǔn)品，中國(guó)藥品生物鑒定所；甲醇(色譜純)，重慶迪馬工業(yè)有限責(zé)任公司；乙腈(色譜純)，重慶迪馬工業(yè)有限責(zé)任公司；娃哈哈純凈水，杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司；正己烷，天津市福晨化學(xué)試劑廠；氫氧化鈉，天津市福晨化學(xué)試劑廠；肝素鈉，北京索萊寶科技有限公司；氮?dú)?，哈爾濱春霖氣體有限公司。實(shí)驗(yàn)所用其他試劑均為色譜級(jí)別。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，清潔級(jí)Sprague-Dawley(SD)大鼠12只，雄性，3月齡，體質(zhì)量(200±20)g，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(黑)2013-004。

1.4 制備花旗澤仁水煎液

取花旗澤仁、西洋參浸泡12 h，分別煎煮，合并3次水煎液，過(guò)濾后花旗澤仁組水浴濃縮至每毫升含0.54 g生藥藥液，西洋參水浴濃縮至每毫升含0.135生藥藥液。4℃保存。

1.5 色譜與質(zhì)譜條件

1.5.1 色譜條件

液相色譜：色譜柱為C18柱(1.8 μm，100 mm×3.0 mm，Agilent Technologies，美國(guó))，流動(dòng)相：A相為水(含0.1%甲酸)，B相為乙腈。流速0.3 mL/min；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣溫度4 ℃；進(jìn)樣體積為10 μL。在流動(dòng)相中加入0.1%甲酸以改善色譜峰形。梯度洗脫方式，樣品的分析周期為12 min。洗脫程序見(jiàn)表1。

1.5.2 質(zhì)譜條件

采用液相色譜/四級(jí)桿-飛行時(shí)間串聯(lián)液質(zhì)聯(lián)用儀，液相色譜接口為電噴霧離子化離子源，負(fù)離子檢測(cè)模式。離子源電壓3 500 V、霧化器流速10 L/min、霧化器溫度350 ℃、干燥氣溫度350 ℃、干燥氣流速10 L/min、掃描頻率2 amu/s、掃描范圍100～1 300 amu、霧化器壓力50 V、毛細(xì)管電壓3 500 V。人參皂苷Rb1的質(zhì)譜參數(shù)為1 107.596 0。

表1 流動(dòng)相洗脫程序

1.6 血漿樣品處理方法

移取100 μL血漿樣品，準(zhǔn)確加入500 μL含內(nèi)標(biāo)(地西泮為0.1 μg/mL)的甲醇溶液進(jìn)行蛋白沉淀法(Protein Precipitation，PP)處理，2 min渦旋，10 min高速離心4℃12 000 rpm，取上清液于30℃氮?dú)饬飨麓蹈桑?00 μL甲醇加入殘?jiān)瑴u旋使復(fù)溶，12 000 rpm高速離心10 min，取上清液進(jìn)行HPLC-MS/MS分析，進(jìn)樣體積為10 μL。

1.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿樣品與質(zhì)控(quality control, QC)樣品的配制

儲(chǔ)備液配制：精密稱取5 mg地西泮(Diazepam)，溶劑為甲醇，制濃度為200 μg/mL的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。人參皂苷Rb14 mg，溶劑為甲醇，制濃度為400 μg/mL的儲(chǔ)備液。-20℃保存儲(chǔ)備液。

工作液配制：精密移取儲(chǔ)備液，以甲醇為溶劑制備人參皂苷Rb1一系列混合工作液為：1、2、4、10、20、40、100、200 μg/mL。

將配置好的一系列混合工作溶液，以空白血漿作為溶劑進(jìn)行1:20比例稀釋，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿樣品，人參皂苷Rb1濃度范圍為0.05～10 μg/mL。

QC樣品同法稀釋配制，配制人參皂苷Rb1濃度為0.1、1、8 μg/mL。

1.8 人參皂苷Rb1在大鼠血漿中的比較藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

取SD大鼠12只，雌性，隨機(jī)分為2組，分別給予花旗澤仁、西洋參水煎液，劑量為1 mL/100 g體質(zhì)量。花旗澤仁組于給藥前及給藥后0.25、0.5、0.75，1、2、3、4、6、8、12、24、48 h由眼眶靜脈叢取血約0.5 mL。西洋參組給藥前及給藥后0、0.25、0.5、0.75，1、2、3、4、6、8、12、24、48 h由眼眶靜脈叢取血約0.5 mL。均肝素抗凝，離心4 000 rpm，時(shí)間為5 min，取血漿，按照1.6項(xiàng)下操作處理血漿樣品。

1.9 藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)處理

利用DAS2.0數(shù)據(jù)處理軟件的非房室模型法(統(tǒng)計(jì)矩法)計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，包括：峰值濃度(Cmax)、濃度達(dá)峰時(shí)間(Tmax)、消除半衰期(t1/2)、藥-時(shí)曲線下面積(AUC)、平均駐留時(shí)間(MRT)、血漿清除率(CL)等。

統(tǒng)計(jì)學(xué)差異采用軟件SPSS19.0進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)驗(yàn)證

2.1.1 選擇性

人參皂苷Rb1和內(nèi)標(biāo)采用負(fù)離子模式對(duì)待測(cè)成分進(jìn)行監(jiān)測(cè)。待測(cè)組分的MS/MS產(chǎn)物離子圖譜見(jiàn)圖1。地西泮為人參皂苷Rb1的內(nèi)標(biāo)。分別對(duì)內(nèi)標(biāo)物、人參皂苷Rb1血漿樣品、空白血漿樣品添加的待測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行液質(zhì)掃描，如圖2可觀察到空白血漿中的其他內(nèi)源性成分對(duì)測(cè)定物不造成干擾，圖2顯示，人參皂苷Rb1保留時(shí)間為6.18 min，內(nèi)標(biāo)物地西泮的保留為1. 67 min。

圖1 人參皂苷Rb1產(chǎn)物離子

圖2 地西泮(1)人參皂苷Rb1(2)的血漿樣品色譜圖：空白血漿(A)；空白血漿添加的待測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)(B)；給藥2 h后的實(shí)測(cè)血漿樣品(C)

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量下限(Lower limit of quantification，LLOQ)

以標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品濃度為橫坐標(biāo)X，以人參皂苷Rb1峰面積與內(nèi)標(biāo)物地西泮峰面積作比為縱坐標(biāo)Y，分別采用1/X加權(quán)最小二乘法進(jìn)行線性回歸，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性回歸方程為Y=3.346 8X-0.052 8，R2=0.998 5。最低定量下限(S/N=1∶10)為0.05 μg/mL。

2.1.3 精密度和準(zhǔn)確度

將配制好的QC樣品分別按照血漿樣品處理方法進(jìn)樣分析，于日內(nèi)進(jìn)行6次測(cè)定，得到待測(cè)組分及內(nèi)標(biāo)峰面積值，分別帶入回歸方程計(jì)算濃度值，求算日內(nèi)精密度與準(zhǔn)確度。于日間進(jìn)行6次測(cè)定,求算日間精密度和準(zhǔn)確度。

表2 待測(cè)組分在大鼠血漿中的精密度和準(zhǔn)確度

精密度表示為相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)應(yīng)≤20%，準(zhǔn)確度表示為相對(duì)偏差(RE)應(yīng)在±20%范圍內(nèi)。如表4所示，人參皂苷Rb1日內(nèi)與日間精密度(RSD)分別為6.3%～8.7%與5.2%～9.0%，日內(nèi)與日間準(zhǔn)確度(RE)分別為2.4%～6.7%與-1.5%～3.2%。根據(jù)數(shù)據(jù)表明待測(cè)組分在大鼠血漿中的精密度和準(zhǔn)確度均符合分析要求。

2.1.4 基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率

將配制好的QC樣品按照血漿樣品處理方法進(jìn)樣分析，測(cè)得待測(cè)成分與內(nèi)標(biāo)峰面積A3。將2組不同個(gè)體的空白血漿樣品(n=6)分別按照血漿樣品處理方法操作后，分別加入與QC樣品同等濃度的人參皂苷Rb1與內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣分析測(cè)得峰面積A2。將上述混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣分析，得到峰面積A1。

絕對(duì)基質(zhì)效應(yīng)為A2/ A1；提取回收率為A3/A2。

表3列出了人參皂苷Rb1與內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率結(jié)果。由此表可知在三個(gè)濃度下，活性成分均存在一定的基質(zhì)效應(yīng)，均在85%～115%范圍內(nèi)，且精密度RSD均小于20%，符合生物樣品分析要求。提取回收率結(jié)果顯示在血漿樣品前處理?xiàng)l件下，蛋白沉淀法對(duì)人參皂苷Rb1的提取回收率均大于80%。可見(jiàn)人參皂苷Rb1采用血漿處理方法提取回收率良好。

表3 待測(cè)組分在大鼠血漿中的基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率(n=6)

2.1.5 樣品穩(wěn)定性

配制好的QC樣品分別做如下處理：①反復(fù)動(dòng)融3次后按照血漿樣品處理方法后進(jìn)樣分析；②室溫下25℃放置4 h后按照血漿樣品處理方法操作進(jìn)樣分析；③置于-80℃冷凍2周后取出解凍后按照血漿樣品處理方法操作進(jìn)樣分析；④按照血漿樣品處理方法操作后置于自動(dòng)進(jìn)樣器(4℃)12 h后進(jìn)樣分析。將上述測(cè)得峰面積值帶入回歸方程求算血藥濃度。

表4 待測(cè)組分在大鼠血漿中的穩(wěn)定性

見(jiàn)表4，三個(gè)QC濃度的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品的3次凍融循環(huán)后的穩(wěn)定性結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為7.3%～14.9%，相對(duì)偏差RE為-5.2%～4.1%；室溫下25℃放置4h的短期穩(wěn)定性考察結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為7.5%～12.6%，相對(duì)偏差RE為-3.2%～3.8%；-80℃冷凍條件下保存2周的穩(wěn)定性結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為5.9%～10.1%，相對(duì)偏差RE為-2.4%～3.1%；以及樣品處理后置于自動(dòng)機(jī)進(jìn)樣器(4℃)中12h的穩(wěn)定性結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為9.7%～10.6%，相對(duì)偏差RE為-3.5%～3.0%，RSD結(jié)果均小于20%，RE均在±20%范圍內(nèi)，表明待測(cè)組分在大鼠血漿中的穩(wěn)定性符合生物樣品的分析要求。

2.2 花旗澤仁組、西洋參組中主要有效成分比較藥代動(dòng)力學(xué)

表5 大鼠口服不同水煎液后人參皂苷Rb1的血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)(ng/mL)

注:n.d.未檢測(cè)到，低于LLOQ.

表6 大鼠口服不同水煎液后人參皂苷Rb1的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

注:與西洋參組比較，*P<0.05,**P<0.01

圖3 大鼠口服不同提取物后人參皂苷Rb1的平均血藥濃度-時(shí)間曲線

3 討論

本實(shí)驗(yàn)利用已建立的LC-MS/MS檢測(cè)大鼠血漿中指標(biāo)成分的方法，測(cè)定正常大鼠分別灌胃花旗澤仁、西洋參后不同時(shí)間點(diǎn)指標(biāo)成分在大鼠血漿樣品中的濃度，利用DAS2.0藥代動(dòng)力學(xué)軟件，進(jìn)行血藥濃度分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明配伍后在大鼠體內(nèi)吸收良好，體內(nèi)存留量適宜。從MRT和t1/2值可以看出，配伍后活性成分人參皂苷Rb1在體內(nèi)消除較慢。在一定時(shí)間可以維持穩(wěn)定的藥物治療濃度。西洋參組中人參皂苷Rb1藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)結(jié)果表明與花旗澤仁組中人參皂苷Rb1在大鼠體內(nèi)代謝過(guò)程基本類似，根據(jù)數(shù)據(jù)可顯示其吸收較好，在體內(nèi)的存留量適宜，體內(nèi)消除較慢，在一定的時(shí)間內(nèi)也可維持穩(wěn)定的藥物治療濃度。

與西洋參組相比，花旗澤仁組人參皂苷Rb1的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)有顯著性的變化，其中Cmax增大，藥時(shí)曲線下面積AUC0-t增加，半衰期t1/2與平均駐留時(shí)間MRT0-t明顯延長(zhǎng)，清除率CL顯著降低，此外血藥濃度達(dá)峰時(shí)間延長(zhǎng)，說(shuō)明組方配伍可延長(zhǎng)人參皂苷Rb1在體內(nèi)的吸收時(shí)間，提高人參皂苷Rb1的血藥濃度，增加其在體內(nèi)的吸收程度，并減慢其代謝速度，增加其在體內(nèi)的駐留時(shí)間，復(fù)方配伍后起到了延長(zhǎng)人參皂苷Rb1

在體內(nèi)作用時(shí)間的作用(見(jiàn)表6)。更有利于人參皂苷Rb1發(fā)揮降血糖、改善胰島素抵抗等藥理作用。

人參皂苷Rb1在大鼠體內(nèi)的吸收增加，經(jīng)查閱文獻(xiàn)報(bào)道[8]，人參皂苷Rb1的吸收過(guò)程屬于被動(dòng)擴(kuò)散，人參皂昔Rbl是藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P-gp底物，受到P-gp外泵作用，致使人參皂苷Rb1在大鼠體內(nèi)的生物利用度較低。配伍后Cmax與AUC0-t明顯升高，提高了人參皂苷Rb1在大鼠的體內(nèi)血藥濃度，可能是由于花旗澤仁配伍后某種成分抑制了P-gp轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，或與P-gp存在競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合作用，導(dǎo)致人參皂苷Rb1受P-gp蛋白的外排作用減弱，進(jìn)而改變了人參皂苷Rb1在正常大鼠體內(nèi)的吸收行為。

對(duì)于花旗澤仁治療2型糖尿病而言，活性成分在胰島素抵抗發(fā)生相關(guān)組織中的分布水平可能顯得更為重要。我們將繼續(xù)進(jìn)行探索。