李慧杰，齊元富，李秀榮，張盈盈

(山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟南 250014)

腫瘤干細胞是腫瘤組織中存在的一小部分具有自我更新能力和分化潛能的細胞，亦是腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的根源[1]。腫瘤轉(zhuǎn)移過程中存在免疫逃逸現(xiàn)象，而免疫重塑是最終導(dǎo)致逃逸的關(guān)鍵[2]。中醫(yī)藥防治腫瘤在改善機體免疫功能、提高患者生活質(zhì)量方面彰顯優(yōu)勢，基于此，筆者觀察了芪連扶正膠囊對肺癌干細胞(Lung cancer stem cell, LCSC)免疫相關(guān)因子白介素-10(Interleukin-10，IL-10)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、叉狀頭/翅膀狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子(Forkhead/winged helix transcription factor，F(xiàn)oxp3)表達的影響，意在探討其調(diào)節(jié)肺癌干細胞免疫重塑情況，以期為抑制肺癌轉(zhuǎn)移及肺癌治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞與動物

細胞為山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中心實驗室惠贈的人肺腺癌細胞系A(chǔ)549細胞株。實驗動物為濟南朋悅實驗動物繁育有限公司SPF級體質(zhì)量(200±10)g、雄性SD大鼠(質(zhì)量合格證號SCXK(魯)20140007)。

1.2 主要試劑藥品

芪連扶正膠囊(山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院Z01080226);注射用順鉑(齊魯制藥有限公司H20023461);RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(天津市灝洋生物制品科技有限公司);CD133細胞分離試劑盒、PE標記的CD133抗體(美國Gene Copoeia公司);Elisa檢測試劑盒(南京巴傲得生物科技有限公司);BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒、Foxp3一抗、β-actin一抗、標記二抗(北京百奧萊博科技有限公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司);引物(生工生物工程股份有限公司)。

1.3 儀器

德國BB5060UV型CO2培養(yǎng)箱;美國Thermo Forma超凈工作臺及全波長酶標儀;日本Olympus倒置相差顯微鏡;美國Becton Dickinson流式細胞儀;美國Bio-Rad Trans-Blot Turbo轉(zhuǎn)膜儀;美國Bio-rad電泳系統(tǒng);美國Alpha Innotech Fluor Chem Q成像分析系統(tǒng);美國Therm Fisher PCR儀;ROCHE實時熒光定量PCR儀。

1.4 芪連扶正膠囊含藥血清制備

購買體質(zhì)量(200±10)g的雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5天；隨機分為芪連扶正膠囊組及對照組，芪連扶正膠囊組大鼠灌胃應(yīng)用芪連扶正膠囊溶液，對照組應(yīng)用等量生理鹽水，每日灌胃1次、連續(xù)灌14 d；末次灌胃前12 h禁食，末次灌胃后1 h10%水合氯醛麻醉大鼠；經(jīng)腹主動脈取血，離心取血清，0.22 μm微孔濾膜過濾，保存于-80℃冰箱備用。

1.5 免疫磁珠法分選肺癌干細胞

常規(guī)培養(yǎng)細胞，消化收集細胞，調(diào)整細胞濃度,清洗、加入緩沖液重懸細胞，按CD133細胞分離試劑盒說明逐步進行，流式細胞儀檢測陽性細胞的百分率，分選的CD133+陽性比例為80.79%，可用于后續(xù)實驗。

1.6 Elisa法檢測IL-10、TGF-β1

常規(guī)培養(yǎng)細胞，按實驗分組干預(yù)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，離心收集，保存于-80℃冰箱備用；檢測時，配制標準品，加樣，封板溫育30 min，洗板，加酶標試劑，重復(fù)后加顯色劑，震蕩混勻，避光顯色15 min，加終止液，酶標儀450 nm波長下測定各孔吸光度值(OD值)，計算數(shù)據(jù)。

1.7 Western blot檢測Foxp3

常規(guī)培養(yǎng)細胞，按實驗分組干預(yù)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，提取蛋白，BCA試劑盒蛋白定量。組裝固定玻璃板，分別灌分離膠、濃縮膠，插入梳子，待濃縮膠完全聚合后放入電泳槽內(nèi)固定，加電泳緩沖液，拔出梳子，加樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，麗春紅染色，5%脫脂奶粉封閉，一抗4℃過夜，二抗恒溫搖床1 h，ECL曝光成像，凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。

1.8 RT-PCR法檢測TGF-β1mRNA

常規(guī)培養(yǎng)細胞，按實驗分組加藥，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，逐步提取總RNA，測定RNA濃度，標準內(nèi)進行后續(xù)實驗；其中引物序列為TGF-β1上游5＇-GTACCTGAACCCGTGTTGCT -3＇、下游5＇-GTATCGCAGGAATTGTTGC -3＇；GAPDH上游5＇-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG -3＇、下游5＇-AGGGGCCATCCACAGTCTTC -3＇；根據(jù)說明書逐步合成cDNA，PCR擴增，上機檢測，根據(jù)公式2-△△CT處理實驗數(shù)據(jù)。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

運用IBM SPSS19.0軟件，數(shù)據(jù)處理采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Elisa檢測肺癌干細胞IL-10、TGF-β1表達情況

經(jīng)單因素方差分析，與對照組相比，各藥組均可降低細胞IL-10和TGF-β1的表達(P<0.05或P<0.01)；與DDP組相比，芪連扶正膠囊組及聯(lián)合組的IL-10和TGF-β1表達情況均與之差異顯著(P<0.05或P<0.01)。見表1。

2.2 Western blot檢測肺癌干細胞Foxp3表達情況

對照組、芪連扶正膠囊組、順鉑組、聯(lián)合組的肺癌干細胞Foxp3表達量分別為：(54.36±3.59)%，(41.20±4.03)%，(35.28±4.12)%，(26.51±3.96)%；經(jīng)單因素方差分析，與對照組相比，各藥組均可降低Foxp3表達(P<0.05或P<0.01)，兩藥聯(lián)合效果最佳,見圖1。

表1 Elisa檢測肺癌干細胞IL-10、TGF-β1表達情況

注：與對照組比較，▲P<0.05,▲▲P<0.01;與順鉑組比較，*P<0.05,**P<0.01

圖1 Foxp3 Western blot圖(注：圖片從左到右依次為對照組、芪連扶正膠囊組、順鉑組、聯(lián)合組)

2.3 RT-PCR檢測肺癌干細胞TGF-β1mRNA表達情況

對照組、芪連扶正膠囊組、順鉑組、聯(lián)合組的肺癌干細胞TGF-β1mRNA表達量分別為：(1.27±0.26)%，(1.01±0.20)%，(0.77±0.14)%，(0.50±0.10)%；經(jīng)單因素方差分析，與對照組相比，各藥組均可降低TGF-β1mRNA表達(P<0.05或P<0.01)，其中芪連扶正膠囊聯(lián)合順鉑組差異最顯著,見圖2。

圖2 TGF-β1mRNA PCR圖

3 討論

早在1980年LCSC就被證實存在于肺癌組織中，它是來源于肺癌的一部分細胞群，具有自我更新、增殖分化、強致瘤性、且可被特異性標記物標記[3]?；谀[瘤干細胞理論，多項研究結(jié)果證實了LCSC與肺癌發(fā)生、侵襲、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，是肺癌轉(zhuǎn)移的根源和潛在的治療靶點。LCSC因自我更新特性在肺癌發(fā)生時已占據(jù)優(yōu)勢，并不斷增殖促進肺癌細胞生長，待生長到一定程度時，因增殖的肺癌細胞需要更多營養(yǎng)物質(zhì)，LCSC便利用其多向分化能力轉(zhuǎn)分化為內(nèi)皮細胞樣細胞，構(gòu)建組織中的腫瘤血管形成，加速腫瘤生長；一旦腫瘤被發(fā)現(xiàn)并經(jīng)手術(shù)、放化療等治療后，肺癌細胞被大部分殺傷，但LCSC卻可幸免，并在外干預(yù)停止后復(fù)燃肺癌細胞，導(dǎo)致肺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移[4-5]。

機體免疫系統(tǒng)具有抗腫瘤的保護功能，以及對腫瘤的重新塑型功能，我們將后者稱之“免疫重塑”，即免疫系統(tǒng)不斷殺傷較高免疫原性的腫瘤細胞，同時忽略低免疫原性的腫瘤細胞，逐漸出現(xiàn)免疫原性更低、惡性程度更高的腫瘤表型，并在體內(nèi)存留下來的過程[6]。免疫重塑不但可以影響機體免疫系統(tǒng)對腫瘤進行重塑與編輯，亦可改變機體免疫系統(tǒng)相關(guān)成分，從而更利于腫瘤免疫逃逸的形成，腫瘤發(fā)生浸潤轉(zhuǎn)移。免疫重塑的腫瘤細胞能產(chǎn)生大量抑制性細胞因子，如IL-10、TGF-β等，其通過直接接觸及誘導(dǎo)該類因子削弱CTL細胞、NK細胞的殺傷活性，進而逃逸機體免疫監(jiān)視，促進腫瘤轉(zhuǎn)移[7-8]。其中，IL-10是參與腫瘤免疫逃逸的重要免疫抑制因子，具有雙向免疫調(diào)節(jié)特性，其介導(dǎo)免疫抑制機制是通過作用于不同免疫細胞亞群多途徑發(fā)揮免疫抑制，促進機體抗腫瘤免疫逃逸[9]。TGF-β可直接或間接作用于免疫細胞，誘導(dǎo)其功能缺失，幫助腫瘤逃避機體免疫監(jiān)視功能，促進腫瘤發(fā)展；另外，TGF-β可促進腫瘤組織血管生成、加速腫瘤細胞和外基質(zhì)之間相互作用，抑制機體免疫，利于腫瘤生長及加速其浸潤轉(zhuǎn)移[10-11]。而Foxp3是調(diào)節(jié)性T細胞最特異的生物學(xué)標記，在部分腫瘤中使腫瘤細胞具有了類Treg功能，該功能可抑制機體產(chǎn)生有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答，終致腫瘤免疫逃逸、腫瘤進展，且有研究發(fā)現(xiàn)肺癌中Foxp3表達與TGF-β1、IL-35等免疫抑制因子的表達呈正相關(guān)，提示FOXP3參與肺癌免疫逃逸，抑制機體抗腫瘤功能，促進腫瘤進展[12-13]。

芪連扶正膠囊由黃芪、連翹等11味藥物組成，是山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室生產(chǎn)的具有解毒化痰、消積散結(jié)、扶正抗癌之效的抗腫瘤中成藥，已廣泛應(yīng)用于臨床多年。前期我們進行了相關(guān)研究，臨床研究觀察了芪連扶正膠囊對化療患者免疫功能的影響，結(jié)果顯示：芪連扶正膠囊組促進白細胞及中性粒細胞至正常水平，有效率高達94.29%，T淋巴細胞亞群及NK細胞活性亦較對照組改善明顯，可保護機體免疫功能[14]；芪連扶正膠囊聯(lián)合化療治療晚期非小細胞肺癌，可改善患者大部分臨床癥狀，提高其生活質(zhì)量，不僅能保護機體免疫功能，還可減輕化療毒副作用，且維持治療能延長晚期非小細胞肺癌患者無疾病進展生存期[15]。實驗研究發(fā)現(xiàn)芪連扶正膠囊可使荷瘤小鼠的免疫器官重量增加，可提高小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能，增強荷瘤小鼠的NK細胞活性；且芪連扶正膠囊可通過調(diào)控TGF-β通路抑制肺癌A549細胞的增殖侵襲，進而延緩腫瘤發(fā)展[16-17]。前期研究從不同角度證實芪連扶正膠囊具有提高機體免疫力、抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移作用，但具體機制有待進一步闡明。本研究觀察了芪連扶正膠囊含藥血清對肺癌干細胞免疫相關(guān)因子IL-10、TGF-β1、Foxp3表達的影響，結(jié)果顯示芪連扶正膠囊可明顯降低IL-10、TGF-β1表達，下調(diào)FOXP3及TGF-β1mRNA表達，改善肺癌干細胞免疫抑制狀態(tài)。

綜上可知，肺癌干細胞是肺癌轉(zhuǎn)移的根源，免疫重塑加速肺癌轉(zhuǎn)移，IL-10、TGF-β、FOXP3等免疫相關(guān)因子在免疫重塑過程中發(fā)揮重要作用，而芪連扶正膠囊可通過降低IL-10、TGF-β1、Foxp3表達水平改善細胞免疫抑制狀態(tài)，進而發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫重塑、抑制肺癌轉(zhuǎn)移的作用。基于此，進一步探尋中醫(yī)藥免疫治療靶點可為抑制肺癌轉(zhuǎn)移及肺癌綜合治療提供新策略。