鄒林蓁，蔣海強(qiáng)，周洪雷，李運(yùn)倫

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 高血壓國(guó)家中醫(yī)臨床研究基地，山東 濟(jì)南 250011)

黃連為毛莨科植物黃連(CoptischinensisFranch.)、三角葉黃連(CoptisdeltoideaC. Y. Cheng et Hsiao)和云連(CoptisteetaWall.) 的干燥根莖，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，《藥性解》認(rèn)為黃連味苦性寒，無(wú)毒，入心經(jīng)。主心火炎，目疾暴發(fā)，瘡瘍紅腫，驚悸煩躁，天行熱疾；《神農(nóng)本草經(jīng)》認(rèn)為黃連“主治熱氣，目痛，眥傷，泣出，明目，腸澼，腹痛，下痢，婦人陰中腫痛，久服令人不忘”。廣泛應(yīng)用于濕熱內(nèi)蘊(yùn)、溫病熱毒、心火亢盛引起的嘔吐瀉痢、熱毒瘡瘍等癥[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，其有效成分小檗堿具有抗病原微生物、抗心律失常、降壓、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗癌和降血糖的作用[2]，現(xiàn)有的文獻(xiàn)報(bào)道多側(cè)重于黃連降血壓的直接臨床觀察或分子生物學(xué)研究，鮮有從代謝層面觀察其降壓本質(zhì)的大鼠實(shí)驗(yàn)研究。本研究以自發(fā)性高血壓大鼠作為研究對(duì)象，采用超高液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(HPLC-TOF/MS)方法及多種模式識(shí)別分析方法，研究SHR大鼠尿液干預(yù)前后的變化，挖掘高血壓潛在標(biāo)志物，分析相關(guān)的通路，尋找黃連降血壓的作用機(jī)制，以代謝組學(xué)的平臺(tái)闡述其參與的代謝通路與血壓調(diào)節(jié)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 黃連及其提取液的制備

中藥黃連購(gòu)自山東中醫(yī)藥大學(xué)，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院周紅雷教授鑒定為道地藥材，所購(gòu)黃連中鑒定的化學(xué)成分均依據(jù)《中國(guó)藥典》驗(yàn)證，每克黃連含小檗堿7.63 mg，鹽酸藥根堿6.01 mg，表小檗堿6.91 mg，黃連堿5.09 mg，鹽酸巴馬汀7.22 mg，每公斤生藥粉末以95%乙醇提取，浸泡1 h，回流提取3次，濃縮減壓制成醇提液；濾渣以相同條件溶于水,經(jīng)水提取，濾后在60℃蒸發(fā)濃縮，合并提取液，提取液黃連的濃度為1 g/mL，放置4℃保存。

1.2 分組及給藥

本研究草案經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審批，所有做法均致力于減輕實(shí)驗(yàn)動(dòng)物痛苦。24只SHR雄性大鼠(200～220 g)及7只Wistar雄性大鼠購(gòu)自北京維通利華(Vital River)公司，證書(shū)編號(hào)：SCXK(北京)2012-0001。自由取食、飲水，每天給予12 h的光照，飼養(yǎng)環(huán)境溫度維持在(25±2)℃，相對(duì)濕度50%±10%，所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，每只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物被單獨(dú)放置于代謝籠中，每24 h收集一次尿液樣本。24只SHR大鼠被隨機(jī)分為3組：黃連組(n=8)，每天給藥1次，給藥體積10.001 g/kg；模型組(n=8)，每天給藥1次，給予等體積的生理鹽水;陽(yáng)性藥物對(duì)照組(n=8)，每天給藥纈沙坦1次，給藥體積10 mg/kg。7只Wistar大鼠定為正常對(duì)照組，給藥方式與模型組相同，所有動(dòng)物連續(xù)給藥28 d。

1.3 大鼠尿液樣本采集及血壓測(cè)量

1.4 HPLC-TOF/MS分析

1.4.1 色譜條件

Halo-C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,2.7 μm,Advanced Materials Technology,Wilmington Delaware,美國(guó))，柱溫25℃，流動(dòng)相0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)，體積流量0.35 mL/min，進(jìn)樣體積5 μL，梯度洗脫條件：0～15 min,10%～60%B,15～20 min,60%～60% B,20～24 min,60%～100% B,24～32 min,100%～100% B。

1.4.2 質(zhì)譜條件

采用Agilent-6230 time-of-flight (TOF) 質(zhì)譜儀，電噴霧正離子模式(ESI+)，相關(guān)參數(shù)設(shè)置如下：離子源溫度 120℃，毛細(xì)管電壓4 000.0 V，霧化氣壓35 psi，脫溶劑氣溫度350℃，脫溶劑氣流量9 L/min，采樣錐電壓40 V，碰撞能量電壓175 V，MS掃描范圍m/z 100～1 000，碰撞氣體為氦氣。

1.4.3 數(shù)據(jù)處理及分析

采用Mass Hunter Qualitative Analysis軟件(Agilent Technologies,USA)及R語(yǔ)言(R×64 3.2.2),對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行去噪峰識(shí)別、峰對(duì)齊、峰校正和保留時(shí)間校正，得到質(zhì)荷比、保留時(shí)間、峰強(qiáng)度組成的三維矩陣，用Metaboanalyst對(duì)矩陣進(jìn)行歸一化。統(tǒng)計(jì)方法使用ANOVA(P<0.05)及Fold Change (FC=1.2)。主成分分析(Principal component analysis,PCA)及偏最小二乘法(Partial least squares-discriminant analysis,PLS-DA)通過(guò)SIMCA-P軟件進(jìn)行，VIP值大于1的變量被認(rèn)為有意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠血壓比較

黃連組大鼠平均動(dòng)脈壓在干預(yù)前顯著高于正常對(duì)照組，經(jīng)過(guò)4周干預(yù)后，黃連組在第4周降至最低，與模型組相比，平均動(dòng)脈壓顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1 平均動(dòng)脈血壓

2.2 尿液樣本HPLC-TOF/MS分析

總離子流圖如圖2所示，在正離子模式下，正常對(duì)照組大鼠的總離子流圖在峰數(shù)量和峰面積方面與模型組大鼠不同，經(jīng)黃連干預(yù)后，黃連組總離子流圖同模型組存在明顯差異，在本實(shí)驗(yàn)條件下，8～50 min期間峰形態(tài)及峰數(shù)量存在一定變化，說(shuō)明3組尿液樣本中的內(nèi)源性代謝物存在顯著差異。

圖2 總離子流圖

2.3 模式識(shí)別與判別分析

由于纈沙坦在大鼠體內(nèi)干預(yù)靶點(diǎn)單一，可能會(huì)對(duì)其他三組數(shù)據(jù)造成擾動(dòng)，故本研究納入黃連組、模型組和正常組，將三組樣本的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA分析，得到PCA得分圖及PLS-DA圖，見(jiàn)圖3。

圖3 PCA及PLS-DA

2.4 組間差異代謝物的鑒定

通過(guò)PLS-DA分析篩選出VIP值大于1的變量，得到其保留時(shí)間和質(zhì)核比，并對(duì)這些變量進(jìn)一步進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA，去除P值大于0.05的變量)和Fold change (FC>2)，將差異變量作為潛在生物標(biāo)志物，根據(jù)標(biāo)志物的精確分子量在HMDB、Metlin、KEGG等網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，同時(shí)參照有關(guān)文獻(xiàn)，解析化合物質(zhì)譜并結(jié)合二級(jí)質(zhì)譜確證，最終篩選出顯著差異代謝物11個(gè)，這些標(biāo)志物可作為體現(xiàn)SHR大鼠干預(yù)前后的特征性生物標(biāo)志物，說(shuō)明SHR大鼠的色氨酸代謝、嘧啶代謝、花生四烯酸代謝和膽汁酸代謝存在異常，具體信息見(jiàn)表1。

本次實(shí)驗(yàn)中，Indoleacetic acid (IAA)、Quinaldic acid(QA)、5-Hydroxyindoleacetic acid(5-HIAA)被認(rèn)為變化顯著，黃連干預(yù)后其峰響應(yīng)度均趨向正常組， 5-HIAA的響應(yīng)度增加并趨于正常；PGE2和11-Dehydro-thromboxane B2被認(rèn)為具有顯著變化，PGE2響應(yīng)度下降，Adenine響應(yīng)度上升。

2.5 代謝通路分析

本實(shí)驗(yàn)將鑒定出的11種差異標(biāo)志物的HMDB號(hào)輸入Metaboanalyst網(wǎng)頁(yè)的通路分析模塊，繪制出代謝通路分析圖，共鑒定出4個(gè)代謝通路，包括色氨酸代謝、嘧啶代謝、花生四烯酸代謝和膽汁酸代謝，均為與炎癥反應(yīng)和脂質(zhì)代謝有關(guān)的代謝途徑，這說(shuō)明SHR大鼠存在血管炎癥狀態(tài)，黃連可能通過(guò)參與上述代謝調(diào)節(jié)SHR大鼠血壓；同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)維生素E的代謝和膽汁酸代謝存在異常，在高血壓炎癥狀態(tài)下的SHR大鼠是否同時(shí)存在維生素和膽汁酸代謝的異常，這些具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。見(jiàn)圖4。

3 討論

3.1 脂質(zhì)代謝與炎癥狀態(tài)的調(diào)節(jié)

3.1.1 IDO酶與L-kyn通路，SERT與5-HT通路

QA和IAA是色氨酸-犬尿氨酸(L-tryptophan-L-kyn)分解通路的產(chǎn)物，5-HIAA是色氨酸-5-羥色胺(L-trptophan-5-HT)分解通路的產(chǎn)物。色氨酸代謝與其中的酶被認(rèn)為與健康狀況和脂質(zhì)情況有強(qiáng)烈相關(guān)[3]。其中，IDO酶參與眾多代謝過(guò)程，它可受炎癥因子誘導(dǎo),與年齡、頸動(dòng)脈內(nèi)膜厚度、BMI指數(shù)、LDL和炎癥狀態(tài)呈正相關(guān)，與HDL水平呈負(fù)相關(guān)。上升的LDL和下降的HDL既不利于血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)和功能的完整，也可使IDO酶活性增強(qiáng)，進(jìn)而增加L-kyn代謝通路產(chǎn)物的水平[4]。黃連素具有降脂作用[5]，通過(guò)改善脂質(zhì)代謝影響脂蛋白對(duì)血管壁的作用，影響IDO酶以及其參與的中樞神經(jīng)系統(tǒng)[6]。在給予黃連后，L-kyn通路的產(chǎn)物比模型組下降，說(shuō)明在給予黃連后SHR的L-kyn通路被調(diào)控。另外黃連良好的消炎作用也能通過(guò)改善炎癥狀態(tài)調(diào)節(jié)IDO酶的活性。L-kyn通路在心腦血管調(diào)節(jié)與血壓調(diào)節(jié)中起重要作用[4]，因此黃連或許可以通過(guò)調(diào)節(jié)脂蛋白和炎癥狀態(tài)直接改善血管內(nèi)皮與血流動(dòng)力學(xué)，通過(guò)影響IDO酶間接影響SHR的神經(jīng)系統(tǒng)，達(dá)到調(diào)控血壓的目的。

表1 標(biāo)志物信息

圖4 通路拓?fù)浞治?/p>

5-HIAA是5-HT的分解產(chǎn)物，5-HT被認(rèn)為具有收縮血管與抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用[7]，因此控制5-HT可以控制外周血管的收縮。5-HT的重吸收過(guò)程類似于兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)，重吸收后的5-HT被降解和滅活，不再發(fā)揮腸道和神經(jīng)毒性[8]，在這一過(guò)程起重要作用的是5-HT轉(zhuǎn)運(yùn)體(SERT)，在給予黃連后，5-HIAA的響應(yīng)度增加并趨于正常，我們猜測(cè)黃連作用于SERT從而加速了5-HT的重吸收?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》認(rèn)為黃連“主治下痢”，提示黃連不僅控制外周血管收縮，還可調(diào)節(jié)腸道微環(huán)境，這一假設(shè)值得進(jìn)一步探索。

3.1.2 PGE2與凝血狀態(tài)

炎癥反應(yīng)是諸多心血管疾病共有的病理狀態(tài)。在本次研究中，花生四烯酸的代謝產(chǎn)物PGE2和11-Dehydro-thromboxane B2被認(rèn)為具有顯著變化， PGE2來(lái)自還加氧酶COX2催化的花生四烯酸，參與炎癥反應(yīng)，PGE2具有促進(jìn)血小板聚集的生物學(xué)效應(yīng)[9]，黃連具有良好的抗炎作用，可通過(guò)降低細(xì)胞內(nèi)Ca+濃度抑制COX2mRNA表達(dá)及COX2催化活性、抑制膜磷脂釋放花生四烯酸酶[10]，使PGE2減少，抑制血栓形成，改善高血壓大鼠的血流動(dòng)力學(xué)。

在SHR大鼠的炎癥狀態(tài)下，已檢測(cè)到花生四烯酸代謝的異常；而維生素的代謝、膽汁酸代謝與花生四烯酸代謝可相互影響[11]。維生素E可參與膽汁酸的合成代謝，維生素代謝、膽汁酸代謝可共同影響花生四烯酸代謝。在膽汁酸合成過(guò)程中，起關(guān)鍵作用的7α羥化酶可促進(jìn)膽固醇向膽汁酸的轉(zhuǎn)化[12]。這一轉(zhuǎn)化過(guò)程可以起到保肝、降脂的作用。膽酸螯合劑類藥物可以螯合腸道中的游離膽汁酸促進(jìn)其在糞便的排出[13]，使膽汁酸的腸肝循環(huán)被切斷，激活7α羥化酶，加速更多膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸，進(jìn)而起到降脂保肝的作用。實(shí)驗(yàn)表明，黃連中的主要成分小檗堿可通過(guò)促進(jìn)膽固醇7α羥化酶(CYP7A1)上游調(diào)控因子CXRα/PPARαmRNA的表達(dá)，促進(jìn)大鼠肝內(nèi)CYPTA1mRNA的蛋白表達(dá)及活性，使高脂血大鼠肝內(nèi)膽固醇減少、膽汁酸增加，糞便中膽固醇和膽汁酸的增多[14]。黃連在臨床上被廣泛用于消化疾病，它很可能作用于SHR的腸肝循環(huán)，發(fā)揮類似于降膽寧在膽固醇轉(zhuǎn)化方面的作用。這值得我們獲取更多證據(jù)來(lái)探索黃連在高血壓狀態(tài)下對(duì)腸肝循環(huán)的作用機(jī)制。

3.2 腺嘌呤(Adenine)與炎癥狀態(tài)、能量代謝

在高血壓發(fā)病機(jī)制中，胰島素抵抗和膠原生成升高血壓的作用不可忽視[15]。Adenine是核酸的組成成分，在心肌缺血時(shí)其表達(dá)下調(diào)。Adenine的代謝產(chǎn)物腺苷酸在臨床上被廣泛應(yīng)用以補(bǔ)充心肌能量，黃連具有保護(hù)心肌、提高胰島素敏感性、抑制膠原因子轉(zhuǎn)錄的作用[16]，可通過(guò)增加大鼠左心室肌中cAMP含量增強(qiáng)大鼠的心肌收縮力，提高心室肌內(nèi)NO含量，抑制心肌纖維化及心室重構(gòu)，上述皆作用于對(duì)腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)的調(diào)節(jié)[17]。而且AMPK的激活還可抑制COX2和后來(lái)產(chǎn)生的前列腺素(PGE2)的釋放[18]。炎癥與氧化損傷的修復(fù)除了上文提到的與花生四烯酸、IDO酶的關(guān)系，也與AMPK的激活和NF-KB通道的限制有關(guān)。黃連被認(rèn)為能調(diào)節(jié)NF-KB來(lái)修復(fù)內(nèi)皮功能受損[19]，在本實(shí)驗(yàn)中，PGE2響應(yīng)度下降，Adenine響應(yīng)度上升，可能與黃連激活了AMPK，修復(fù)炎癥狀態(tài)有關(guān)，而這一可能性同時(shí)也能帶來(lái)心肌能量代謝的改變、胰島素抵抗的抑制，減弱膠原對(duì)血管壁的破壞。

3.3 胞啶(Cytidine)與氧化應(yīng)激、脂質(zhì)調(diào)節(jié)

氧化應(yīng)激影響動(dòng)脈彈性和功能，參與多種疾病的病理過(guò)程。嘧啶分解產(chǎn)物β-丙氨酸是肌肽的重要組成成分，肌肽具有抗氧化的作用[20]，可應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激對(duì)高血壓大鼠帶來(lái)的損傷。在對(duì)高脂血癥患者的代謝組學(xué)研究中，也檢測(cè)到了IAA和Cytidine的變化，說(shuō)明高脂血癥患者存在色氨酸代謝和DNA代謝的變化[21]，血脂異常作為心血管疾病的重要危險(xiǎn)因素，可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能異常和氧自由基的增加，這個(gè)病理變化同樣對(duì)血壓有一定的威脅，提示我們IAA、胞啶同時(shí)作為高脂血癥、高血壓病共有的異常代謝物，應(yīng)引起我們足夠的關(guān)注。有研究表明，黃連能顯著降低糖尿病大鼠MDA，ET-2和ICAM-1的水平及動(dòng)脈損傷程度，增加NO和SOD含量[22]，降低ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮損傷程度[23]。黃連還可抑制由過(guò)氧化氫和細(xì)胞色素c誘導(dǎo)的DNA的割裂[24],同樣提示黃連能發(fā)揮對(duì)SHR的生物大分子的保護(hù)作用；伴隨上升的β-丙氨酸能減輕氧化應(yīng)激對(duì)SHR血管及臟器的損害，這可能是黃連參與氧化應(yīng)激的靶點(diǎn)所在。

4 小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)以自發(fā)性高血壓大鼠為研究對(duì)象，運(yùn)用代謝組學(xué)檢測(cè)到其尿液中的異常代謝物，都不是獨(dú)立作用的，參與諸多病理環(huán)節(jié)，應(yīng)引起我們足夠的關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)中，SHR大鼠體內(nèi)有關(guān)炎癥反應(yīng)和脂質(zhì)調(diào)節(jié)的代謝存在干預(yù)前后的差異，通過(guò)觀察5-HT分解產(chǎn)物、膽汁酸代謝產(chǎn)物的變化，以及綜合黃連在臨床中”清中下焦?jié)駸帷钡墓π?，提示我們消化系統(tǒng)在血壓調(diào)節(jié)方面或發(fā)揮著一定作用，這值得我們獲取更多證據(jù)來(lái)探索黃連在高血壓狀態(tài)下對(duì)腸肝循環(huán)的作用機(jī)制。黃連降脂、降壓效用已為現(xiàn)代臨床及實(shí)驗(yàn)廣泛應(yīng)用及驗(yàn)證，但由于中草藥多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，使其作用機(jī)制難以直接闡明。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，黃連能夠干預(yù)病理狀態(tài)下色氨酸代謝、嘧啶代謝、花生四烯酸代謝和膽汁酸代謝，可以通過(guò)調(diào)節(jié)脂蛋白和炎癥狀態(tài)直接改善血管內(nèi)皮與血流動(dòng)力學(xué)，達(dá)到調(diào)控血壓的目的。