梁赤周，虞 淼，秦 麗，徐 永

(1.浙江省農(nóng)藥檢定管理所，浙江 杭州 310020 ； 2.杭州市余杭區(qū)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)檢測站，浙江 杭州 311100)

井岡霉素(jingangmycin)是由吸水鏈霉菌井岡變種產(chǎn)生的水溶性殺菌劑，共有A、B、C、D、E、F 6個(gè)組分，主要活性物質(zhì)為井岡霉素A，其結(jié)構(gòu)式(圖1)。井岡霉素具有強(qiáng)內(nèi)吸性和治療作用，毒性低、對(duì)環(huán)境安全，且具高效性、持效長等特點(diǎn)，是我國南方稻區(qū)防治水稻紋枯病的主要農(nóng)藥品種[1-2]。值得指出的是，要改變井岡霉素?zé)o抗藥性的觀念[3]，在有些地區(qū)病原菌菌株對(duì)井岡霉素已經(jīng)產(chǎn)生抗藥性[4]，在防治水稻紋枯病時(shí)需與其他無交互抗性的藥劑交替使用。

圖1 井岡霉素A化學(xué)結(jié)構(gòu)式

目前對(duì)井岡霉素A殘留分析的研究主要集中于水稻[3，5-6]，其在其他作物上的消解動(dòng)態(tài)、最終殘留方面的研究未見報(bào)道。本文旨在研究6%井岡·嘧苷素水劑(井岡霉素A 4%)防治楊梅褐斑病時(shí)在楊梅中的最終殘留和降解規(guī)律，為井岡霉素在楊梅上的膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、農(nóng)藥的合理安全使用和制定農(nóng)藥殘留限量提供科學(xué)依據(jù)。為此，2016年，在浙江省桐廬縣、浙江省開化縣、湖南省張家界市、貴州省惠水縣開展了6%井岡·嘧苷素水劑在楊梅上的殘留田間試驗(yàn)。在參考文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，建立了楊梅中井岡霉素A的殘留檢測方法，用甲醇渦旋提取楊梅中的井岡霉素A，過有機(jī)濾膜，HPLC-MS/MS檢測，方法前處理過程簡單、快速、靈敏度高，很好地滿足了對(duì)農(nóng)藥殘留分析的要求。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 藥劑及試劑 井岡霉素標(biāo)準(zhǔn)品(99.0%)，德國Dr. ehrenstorfer；6%井岡·嘧苷素水劑，浙江省桐廬匯豐生物科技有限公司。乙腈(HPLC級(jí)，美國Tedia公司)，甲醇(HPLC級(jí)，德國Merck公司)，氯化鈉(AR級(jí)，廣東光華科技股份有限公司)，乙酸銨(色譜純，美國fisher公司)，乙酸(分析純，浙江中星化工試劑有限公司)。

1.1.2 儀器設(shè)備 LC-30AD/QTRAP5500相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(LC-MS-MS)(美國SCIEX公司)，ST 16R高速冷凍離心機(jī)(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)，BSA2202S電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)，DMT-2500多管漩渦混合儀(杭州米歐儀器有限公司)，KQ-500E超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 田間試驗(yàn)設(shè)計(jì) 2016年在浙江省桐廬縣、浙江省開化縣、湖南省張家界市、貴州省惠水縣進(jìn)行田間殘留試驗(yàn)。按農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則要求設(shè)試驗(yàn)小區(qū)，2株楊梅樹為1小區(qū)，重復(fù)3次，小區(qū)間設(shè)保護(hù)行，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照小區(qū)。6%井岡·嘧苷素水劑防治楊梅褐斑病，推薦使用有效成分用藥量為100～300mg/kg；施藥方法為噴霧，施藥3次，間隔7～10d。

1.2.1 消解動(dòng)態(tài)試驗(yàn) 于楊梅成熟期一半大小時(shí)，按有效成分450mg/kg均勻噴霧施藥，設(shè)3個(gè)小區(qū)，處理間設(shè)保護(hù)隔離區(qū)。施藥后2h、1、3、5、7、14、21、28d，在小區(qū)內(nèi)按隨機(jī)方法摘取生長正常、無病害的楊梅果實(shí)，每小區(qū)采摘量≥2kg，裝入樣品袋中包扎妥當(dāng)，貼好標(biāo)簽。

1.2.2 最終殘留試驗(yàn) 按有效成分300和450mg/kg設(shè)2個(gè)施藥劑量，各設(shè)3次和4次施藥2個(gè)處理，施藥間隔期為7d，每個(gè)處理3個(gè)小區(qū)，處理間設(shè)保護(hù)帶，另設(shè)空白對(duì)照小區(qū)。最后1次施藥后3、5、7、14 d，在各小區(qū)內(nèi)按隨機(jī)方法摘取生長正常、無病害的楊梅果實(shí)，每小區(qū)≥2kg，裝入食品袋中包扎妥當(dāng)，貼好標(biāo)簽。

1.3 分析方法

1.3.1 樣品前處理 田間樣本在采集后，8h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。用勻漿機(jī)將楊梅打漿，分取樣品150 g樣品2份，分別裝入封口樣品容器中，貼好標(biāo)簽，保存于-20℃冰箱中。

稱取處理好的楊梅試樣5.00 g(精確至0.01g)于50mL離心管中，加入20.0mL甲醇，2 500r/min渦旋5min，8 000r/min離心3min，上清液轉(zhuǎn)移至15mL離心管中，離心后的殘?jiān)?mL 90%甲醇水溶液復(fù)提1次，合并上清液，混勻。

取5mL上述上清液45℃下氮吹至近干，用水定容至1mL，溶解后過0.22μm濾膜，LC-MS-MS測定。

1.3.2 液相色譜條件 色譜柱：HILIC(100mm×2.1mm×1.7μm)；流動(dòng)相：5mmol/L乙酸銨水溶液(A)和乙腈(B)；流動(dòng)相速度：0.3mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣體積：1μL。液相梯度洗脫程序(表1)。

表1 液相梯度洗脫程序

1.3.3 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源；離子源溫度：550℃；電離方式：ESI+；離子化電壓：5 500V；噴霧氣流速：50L/h；氣簾氣流速：40L/h；碰撞氣流速：約200～600L/h；定量方式：外標(biāo)法。質(zhì)譜其他條件(表2)。

表2 井岡霉素A測定的ESI-MS-MS條件

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線 將井岡霉素標(biāo)準(zhǔn)品用水溶解制成母液，依次稀釋成0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0mg/L的一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，在上述儀器條件下進(jìn)行測定，以井岡霉素A標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，以監(jiān)測離子峰面積為縱坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 添加回收 在空白楊梅樣品中添加井岡霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為0.005、0.05、0.25mg/kg，每個(gè)添加水平設(shè)5個(gè)重復(fù)，充分混勻，然后按照上述方法進(jìn)行提取、測定，計(jì)算添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與靈敏度 以監(jiān)測離子峰面積y為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣濃度x為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，井岡霉素標(biāo)準(zhǔn)樣的線性回歸方程為：y=15 243 042x-41 262，相關(guān)系數(shù)為：R2=1.0，結(jié)果表明，井岡霉素A的監(jiān)測離子峰面積與其相對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液在0.005～1.0mg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。儀器最小檢出量為2.8×10-14g。

2.2 回收率和精密度 井岡霉素在楊梅樣品中的添加回收試驗(yàn)結(jié)果(表3)，當(dāng)添加濃度為0.005、0.05、0.25mg/kg時(shí)，其平均回收率在81.9%～102.5%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.4%～4.7%，滿足殘留分析的要求。井岡霉素A在楊梅中的最低檢測濃度為0.005mg/kg，相關(guān)色譜圖(圖2)

表3 井岡霉素在楊梅中添加回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

A-E依次為：井岡霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.1mg/L)、楊梅空白樣品、添加0.005mg/kg、添加0.05mg/kg、添加0.25mg/kg圖2 井岡霉素在楊梅中添加回收色譜圖

2.3 消解動(dòng)態(tài)試驗(yàn) 6%井岡·嘧苷素水劑以450mg/kg進(jìn)行噴霧施藥，浙江桐廬、浙江開化、湖南張家界、貴州惠水井岡霉素在楊梅上的原始沉積量分別為1.901、0.954、3.055、0.517mg/kg，殘留量隨著時(shí)間推移逐漸降低。施藥后7d，四地的降解率分別為96.9%、97.0%、90.4%、99.6%，符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程。井岡霉素A在楊梅中的消解半衰期為1.5～4.1d。 井岡霉素A在楊梅中的消解動(dòng)力學(xué)參數(shù)(表4)。

表4 井岡霉素A在楊梅中的消解動(dòng)力學(xué)參數(shù)

2.4 最終殘留試驗(yàn) 最終殘留試驗(yàn)結(jié)果表明，6%井岡·嘧苷素水劑分別按照300和450mg/kg的劑量，施藥3次和4次，施藥間隔7d，最后1次施藥后3、5、7、14d，楊梅中井岡霉素A最終殘留量分別為0.009～1.170mg/kg、<0.005～0.711mg/kg、<0.005～0.470mg/kg、<0.005～0.061mg/kg。井岡霉素在楊梅中的最終殘留規(guī)律明顯，殘留量隨著采收間隔期的延長而降低。

3 結(jié)論與討論

3.1 井岡霉素A在楊梅中的平均消解半衰期為1.5～4.1d，屬易降解農(nóng)藥。

3.2 目前我國、CAC及其他國家都未規(guī)定井岡霉素在楊梅上的最大殘留限量，GB 2763-2016中規(guī)定了井岡霉素在稻谷、糙米和小麥上的最大殘留限量均為0.5mg/kg，日本規(guī)定井岡霉素的在水果上的最大殘留限量值為0.05mg/kg。根據(jù)2016年的試驗(yàn)結(jié)果，用藥量300～450mg/kg，施藥3次和4次，末次施藥后7d，井岡霉素A在楊梅中的最終殘留量為<0.005～0.470mg/kg。建議我國井岡霉素在楊梅上的最大殘留限量值為0.5mg/kg。

3.3 建議使用6%井岡·嘧苷素水劑防治楊梅褐斑病，有效成分用藥量100～300mg/kg，最多施藥3次，施藥間隔7d，安全間隔期7d。