謝璟，王榮麗

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，四川瀘州646000)

肺炎鏈球菌是革蘭陽性雙球菌，正常情況下定植于人體上呼吸道，當(dāng)人免疫低下或伴發(fā)病毒感染時(shí)，可發(fā)展成敗血癥、社區(qū)獲得性肺炎、腦膜炎、中耳炎等。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年大約有160萬人死于肺炎鏈球菌肺炎[1,2]。肺炎鏈球菌肺炎常選用抗生素治療，然而，抗生素耐藥肺炎鏈球菌正變得越來越普遍[3]。因此，研究非抗生素類藥物治療肺炎鏈球菌非常必要。大黃素是大黃、何首烏等的提取物，為蒽醌類衍生物，具有抗炎、抗病毒、抗微生物、利尿、舒張血管和抗癌等藥理活性[4]。研究發(fā)現(xiàn)，大黃素可有效抑制多種細(xì)菌感染。近年研究發(fā)現(xiàn)，絲裂原活化蛋白激酶p38(p38 MAPK)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了細(xì)胞增殖、分化、凋亡、炎癥等，被認(rèn)為是介導(dǎo)肺炎鏈球菌所誘導(dǎo)的肺組織炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵信號分子[5]。2018年1～3月，我們觀察了大黃素對肺炎鏈球菌肺炎小鼠肺組織炎癥反應(yīng)及p38 MAPK表達(dá)的影響，探討大黃素對鏈球菌性肺炎的抗炎機(jī)制，為臨床用藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑 清潔級健康雌性BALB/c小鼠32只，4～6周齡，體質(zhì)量(18±1)g，購于重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司。常規(guī)飼養(yǎng)2周后進(jìn)行造模。肺炎鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 49619購自廣東微生物菌種保藏中心。水合氯醛(源葉)；大黃素(索萊寶)；西力欣(頭孢呋辛酯片)；PBS溶液(ASPEN)；小鼠IL-1β、IL-6、TNF-α ELISA試劑盒(欣博盛)；Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa公司)；DAB顯色劑；Western blotting相關(guān)試劑(武漢拜意爾生物科技有限公司)等。

1.2 細(xì)菌懸液配置 肺炎鏈球菌復(fù)蘇后采用血瓊脂培養(yǎng)基(50 mL/L CO2環(huán)境，37.0 ℃恒溫)培育18 h，從瓊脂平板表面刮下肺炎鏈球菌，懸浮于無菌的生理鹽水中，用麥?zhǔn)媳葷岱ㄅ渲?.5號麥?zhǔn)蠞岫鹊募?xì)菌懸液(細(xì)菌濃度約為1.5×108CFU mL)備用。

1.3 動物分組及模型建立 將32只小鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、大黃素組和頭孢呋辛酯組，每只各8只。所有小鼠采用5%水合氯醛5 μL/g腹腔注射麻醉，模型組、大黃素組及頭孢呋辛酯組按照文獻(xiàn)[6]制備小鼠鏈球菌性肺炎模型，用無菌針頭刺破鼻黏膜后，從鼻腔緩緩滴入0.5麥?zhǔn)蠞舛染?0 μL，待其自動吸入，前期經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)行肺組織病理切片已證實(shí)模型成功。對照組刺破鼻黏膜后，從鼻腔滴入50 μL生理鹽水。

1.4 干預(yù)方法 造模成功后第2天，每組進(jìn)行灌胃治療，給藥劑量根據(jù)小鼠體質(zhì)量按成人1 d劑量折算，換算公式參照文獻(xiàn)[7]。大黃素組予以大黃素25 mg/(kg·d)灌胃，頭孢呋辛酯組予以頭孢呋辛酯50 mg/(kg·d)灌胃，對照組及模型組予以等量生理鹽水灌胃，均灌胃1次/d，連續(xù)灌胃7 d。

1.5 肺組織病理觀察 在末次給藥12 h后，將各組小鼠均以5%水合氯醛麻醉，固定于解剖板，打開胸腔，暴露肺組織，分離并取出左肺，以4%多聚甲醛固定后，行脫水、包埋、切片，HE染色，光鏡下觀察肺組織病理學(xué)表現(xiàn)。

1.6 肺組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平檢測 采用ELISA法。取右肺上葉，使用電勻漿機(jī)勻漿后，于4 ℃下，12 000 r/min離心15 min，取上清液，采用雙抗體夾心法檢測肺組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平，具體操作方法按照ELISA試劑盒說明。

1.7 肺組織p38 MAPK mRNA表達(dá)檢測 采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。取右肺中葉于-80 ℃保存，取約100 mg肺組織，通過TRIzol法充分溶解提取組織總RNA。在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，之后再以cDNA為模板行PCR擴(kuò)增。p38 MAPK引物、GAPDH引物由武漢金開瑞生物工程有限公司合成，序列如下：p38 MAPK上游5′-GGAGGTGCCCGAACGATAC-3′，下游5′-TTGGCGTGAATGATGGACTG-3′，擴(kuò)增長度144 bp；GAPDH上游5′-TGAAGGGTGGAGCCAAAAG-3′，下游5′-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3′，擴(kuò)增長度227 bp。結(jié)束PCR后，采用ΔΔCT法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。

1.8 肺組織p38 MAPK蛋白表達(dá)檢測 采用免疫印跡法(Western blotting法)。取右肺下葉-80 ℃保存，組織塊用預(yù)冷的PBS緩沖液漂洗，使用電勻漿機(jī)勻漿后，加入10倍于組織體積的組織蛋白提取試劑(使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑)，冰浴徹底勻漿。將勻漿液冰浴30 min后，于4 ℃、13 000 r/min離心5 min，取上清液。采用BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒測定樣品蛋白濃度。

2 結(jié)果

2.1 肺組織病理表現(xiàn) 對照組肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔內(nèi)無滲出物，肺泡間隔無增厚，間隔內(nèi)毛細(xì)血管無明顯充血、擴(kuò)張充血及炎癥細(xì)胞浸潤。模型組可見肺泡腔內(nèi)充滿滲出的纖維素，肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡間隔增厚及毛細(xì)血管擴(kuò)張明顯，肺間質(zhì)見大量炎性細(xì)胞浸潤。大黃素組可見肺泡腔內(nèi)纖維素滲出較模型組少，部分肺泡結(jié)構(gòu)破壞融合，部分肺泡間隔增厚，肺間質(zhì)有少量炎癥細(xì)胞浸潤，可見少量紅細(xì)胞。頭孢呋辛組可見肺泡腔內(nèi)少量纖維素滲出，部分肺泡間隔增厚，肺泡腔及肺間質(zhì)有少量炎性細(xì)胞浸潤，較模型組輕，可見少量紅細(xì)胞。見圖1。

注：A為對照組；B為模型組；C為頭孢呋辛組；D為大黃素組。

2.2 各組肺組織上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較 模型組肺組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平均較對照組增高(P均<0.05)，大黃素組、頭孢呋辛組肺組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平均較模型組降低(P均<0.05)。見表1。

表1 各組肺組織上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較

2.3 各組肺組織p38 MAPK mRNA表達(dá)比較 模型組p38 MAPK mRNA表達(dá)較對照組增高(P<0.05)，大黃素組p38 MAPK mRNA表達(dá)較模型組降低(P<0.05)。見表2。

2.4 各組肺組織p38 MAPK蛋白表達(dá)比較 模型組p38 MAPK蛋白表達(dá)較對照組增高(P<0.05)，大黃素組p38 MAPK蛋白表達(dá)較模型組降低(P<0.05)。見表2、圖2。

表2 各組肺組織p38 MAPK mRNA及蛋白表達(dá)比較

圖2 各組肺組織p38 MAPK蛋白表達(dá)水平(Western blotting法)

3 討論

肺炎鏈球菌感染性疾病是引起5歲以下兒童死亡的首要原因。目前治療鏈球菌性肺炎常選用抗生素治療，然而，抗生素耐藥性肺炎鏈球菌正變得越來越普遍。每年有120萬新的肺炎鏈球菌感染病例，并且越來越多的肺炎病例是由至少對一種抗生素耐藥的肺炎鏈球菌引起的。耐藥菌株的涌現(xiàn)大大限制了抗生素的治療效果，因此，對肺炎鏈球菌致病機(jī)制的深入研究及新藥的開發(fā)應(yīng)用迫在眉睫。

IL-1β、IL-6和TNF-α是促炎因子，可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的生理功能，并在創(chuàng)傷、疼痛、感染等應(yīng)激過程中起重要作用。機(jī)體感染肺炎鏈球菌時(shí)，巨噬細(xì)胞活化，產(chǎn)生大量IL-1β、IL-6、TNF-α，它們相互協(xié)同[8]。IL-1β、IL-6、TNF-α還可以通過激活p38 MAPK信號通路，促進(jìn)炎癥因子的表達(dá)，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組肺間質(zhì)大量炎性細(xì)胞浸潤，肺組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平較對照組增高，提示肺炎鏈球菌可誘導(dǎo)小鼠發(fā)生強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)。

MAPK信號通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)之一，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、炎癥等，與肺炎鏈球菌肺炎的發(fā)生密切相關(guān)[9]。目前在哺乳動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)有4條MAPK通路，分別為p38 MAPK通路、c-JUN氨基末端激酶/應(yīng)激活化蛋白激酶(JNK/SAPK)通路、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)通路和ERK5通路[10]。其中，p38 MAPK通路是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)樞紐，參與多種細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。p38 MAPK信號通路可被多種應(yīng)激刺激(熱休克、H2O2、缺氧、放射線、紫外線等)、炎性因子[IL-1β、IL-6、TNF-α、人成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)]、脂多糖(LPS)和革蘭陽性細(xì)菌細(xì)胞壁成分激活，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化，促進(jìn)IL-1β、IL-6、TNF-α等多種細(xì)胞因子的表達(dá)，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，并且活化p38 MAPK信號通路，可與ERK、JNK及核因子-κB(NF-κB)等信號通路發(fā)生正反饋，級聯(lián)放大炎癥反應(yīng)[11～13]。Cao等[5]認(rèn)為，p38 MAPK是肺炎鏈球菌所誘導(dǎo)的肺組織炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵信號分子。Li等[14]研究發(fā)現(xiàn)，p38 MAPK信號通路可誘導(dǎo)肺炎鏈球菌小鼠巨噬細(xì)胞大鼠免疫應(yīng)答。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組肺組織p38 MAPK mRNA及蛋白表達(dá)均較對照組增高，結(jié)合模型組肺組織IL-1、IL-6、TNF-α水平較對照組增高，考慮p38 MAPK信號通路活化參與調(diào)控肺炎鏈球菌肺炎小鼠肺組織的炎癥反應(yīng)。

大黃素是大黃、何首烏等中藥的提取物，現(xiàn)代研究表明，大黃素具有廣譜抗微生物活性。Ferro等[15]發(fā)現(xiàn)，大黃素可抑制福氏志賀氏菌和化膿性鏈球菌引起的感染。大黃素對幽門螺旋桿菌具有抑菌作用，抑制效果呈劑量依賴性，進(jìn)一步研究顯示大黃素對幽門螺旋桿菌DNA損傷也呈劑量依賴性[16]。Su等[17]研究發(fā)現(xiàn)，大黃素能抑制金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、甲型鏈球菌等常見病菌甚至醫(yī)院耐藥菌感染，作用機(jī)制可能是破壞細(xì)菌細(xì)胞膜完整性。研究發(fā)現(xiàn)，大黃對包括金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌在內(nèi)的12種微生物有抑菌效果，同時(shí)經(jīng)大黃分離出的大黃素對這些微生物也具有抑菌效果，對鏈球菌的抑菌效果優(yōu)于其他醌類化合物。

本研究結(jié)果顯示，大黃素組肺泡腔內(nèi)纖維素滲出較模型組少、肺間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤減輕，肺組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平較模型組降低，表明大黃素能抑制肺炎鏈球菌感染，減輕鏈球菌性肺炎的炎癥反應(yīng)，降低IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子水平；大黃素組p38 MAPK mRNA及蛋白表達(dá)水平均較模型組低，提示大黃素能抑制p38 MAPK mRNA及蛋白表達(dá)，表明大黃素可能通過抑制p38 MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化，從而減輕肺炎鏈球菌肺炎小鼠肺組織的炎癥反應(yīng)。