劉聲菊，劉國旗，許永劼，高超，潘衛(wèi),2,3，李興

(1貴州醫(yī)科大學(xué)，貴陽550004；2貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院；3貴州省產(chǎn)前診斷中心)

糖尿病腦病是糖尿病嚴(yán)重的慢性并發(fā)癥，主要表現(xiàn)為學(xué)習(xí)、記憶及認(rèn)知功能障礙等[1]。目前，糖尿病腦病的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，亦缺乏有效的防治手段，因此積極尋找糖尿病腦病的藥物已不容忽視。我國是茶葉的資源大國，茶葉一直作為藥用植物被廣泛應(yīng)用，其生理功效和藥理功效受到了廣泛關(guān)注[2]。大量研究表明，綠茶具有降低神經(jīng)退行性疾病發(fā)病率和保護(hù)神經(jīng)等功效[3]。血清藥理學(xué)反映了藥物有效成分在血中的動(dòng)態(tài)變化及相互作用，避免了藥物的物理化學(xué)性質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，能夠更好地模擬藥物在體內(nèi)發(fā)揮作用的過程[4]。目前，對(duì)于含茶血清用于糖尿病腦病體外藥理學(xué)研究的報(bào)道罕見。2017～2018年，我們以大鼠為綠茶浸出液血清供體，觀察綠茶浸出液血清對(duì)乳鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞高糖損傷的保護(hù)作用，探討茶葉保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用機(jī)制，為茶葉用于臨床防治神經(jīng)退行性疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑與儀器 SPF級(jí)(SD)雄鼠6只，體質(zhì)量180～220 g；出生24 h內(nèi)的SD乳鼠，體質(zhì)量3～6 g，均購于貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心。Neurobasal-A培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、B-27、0.25%胰蛋白酶、雙抗均購自美國Gibco公司；AusGeneX胎牛血清購自上海臻諾生物科技有限公司；馬血清購自美國Hyclone公司；L-谷氨酰胺購自碧云天生物技術(shù)研究所；CCK-8試劑盒購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒購自南京建成生物公司；綠茶由貴州省流通環(huán)節(jié)食品安全檢驗(yàn)中心提供。JA2003N型電子天平購自上海菁海儀器有限公司；Thermo-3111型CO2培養(yǎng)箱購自上海旦鼎國際貿(mào)易有限公司；VL-4型無菌操作臺(tái)購自珠海再鑫儀器有限公司；IMARK型酶標(biāo)儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 綠茶浸出液及空白血清制備 稱取綠茶粉末20.0 g，加入100 mL蒸餾水，搖勻，70 ℃條件下水浴1 h，過濾，取濾液濃縮，用蒸餾水定容至原體積的1/2，搖勻，供大鼠灌胃使用。將大鼠隨機(jī)分為2組，每組3只，一組采用綠茶濃縮液20 mL/(kg·d)劑量灌胃，另一組采用生理鹽水20 mL/(kg·d)劑量灌胃，2次/d，連續(xù)3 d。第3天末次灌胃大鼠1.5 h后，股動(dòng)脈取血，經(jīng)3 000 r/min離心10 min，取上層血清，56 ℃滅活30 min，過濾除菌后-80 ℃保存。用Neurobasal-A培養(yǎng)基按倍比稀釋的方法分別配制為25%、50%、100%濃度，作為低、中、高濃度血清待用。

1.3 海馬神經(jīng)細(xì)胞原代培養(yǎng) 取出生24 h內(nèi)SD乳鼠的海馬組織，剪碎、吹打、離心、棄上清后，加入0.125%胰蛋白酶，37 ℃消化15 min，加入等體積的胎牛血清終止消化，200目篩網(wǎng)過濾，制成單細(xì)胞懸液，種植于預(yù)先用L-多聚賴氨酸包被的6孔板和96孔板中，8 h后將種植培養(yǎng)基(83%DMEM培養(yǎng)基+1%L-谷氨酰胺+1%雙抗+10%馬血清+5%胎牛血清)全量換成維持培養(yǎng)基(96%Neurobasal-A+2%B-27+1%L-谷氨酰胺+1%雙抗)培養(yǎng)，以后每48 h半量換液1次。

1.4 分組與干預(yù)方法 海馬神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)至第5天時(shí)，隨機(jī)分為8組，分別為對(duì)照組、高糖組、空白血清低濃度組、空白血清中濃度組、空白血清高濃度組、綠茶低濃度組、綠茶中濃度組、綠茶高濃度組。對(duì)照組按培養(yǎng)基總體積的10%加入維持培養(yǎng)基，并保持葡萄糖濃度為25 mmol/L；高糖組按培養(yǎng)基總體積的10%加入維持培養(yǎng)基，并保持葡萄糖濃度為45 mmol/L；空白血清低、中、高濃度組分別按培養(yǎng)基總體積的10%加入低、中、高濃度空白血清，并保持葡萄糖濃度為45 mmol/L；綠茶低、中、高濃度組分別按培養(yǎng)基總體積的10%加入低、中、高濃度綠茶浸出液血清，并保持葡萄糖濃度為45 mmol/L。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 細(xì)胞形態(tài) 各組干預(yù)后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞胞體、細(xì)胞突觸數(shù)目及形態(tài)改變。

1.5.2 細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) 采用消化離心法收集各組細(xì)胞，細(xì)胞離心成團(tuán)后吸去上清，并加入2.5%戊二醛固定2 h后收集細(xì)胞團(tuán)塊，并用電鏡固定液固定海馬組織，制作超薄組織切片，透射電鏡下觀察各組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。

1.5.3 細(xì)胞損傷情況 采用LDH法。細(xì)胞培養(yǎng)至第7天，收集各組細(xì)胞上清液10 μL于酶標(biāo)包被板中，每組平行做5孔，并設(shè)空白孔，經(jīng)過孵育、加酶、顯色和終止后，以空白孔調(diào)零，在酶標(biāo)儀450 nm波長處測定光密度D(λ)值，以評(píng)價(jià)細(xì)胞損傷情況。

1.5.4 細(xì)胞活性情況 采用CCK-8法。細(xì)胞培養(yǎng)至第7天，向每孔中加入10 μL的CCK-8溶液，每組平行做5孔，并設(shè)空白孔，置于培養(yǎng)箱中孵育2 h后，以空白孔調(diào)零，在酶標(biāo)儀450 nm波長處測定光密度D(λ)值，以評(píng)價(jià)細(xì)胞活性情況。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞形態(tài)變化 對(duì)照組海馬神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)成熟飽滿，體積較大，聚集生長明顯，細(xì)胞質(zhì)豐富，光暈明顯，突起發(fā)達(dá)并向外延伸，同時(shí)變粗且分出許多分支，互相連接形成密集交錯(cuò)的網(wǎng)絡(luò)。與對(duì)照組比較，高糖組海馬神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)多變，胞體內(nèi)出現(xiàn)空泡，突起回縮，呈現(xiàn)出明顯的退變現(xiàn)象。與高糖組比較，空白血清組海馬神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)無明顯差異。各干預(yù)組神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)規(guī)則飽滿，有光暈，突觸明顯增多增長并相互連接成網(wǎng)狀，但高濃度組較低濃度組明顯。

2.2 各組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化 對(duì)照組海馬神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞核形態(tài)規(guī)則，核內(nèi)染色質(zhì)豐富且分布均勻，核仁明顯，細(xì)胞器豐富，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體形態(tài)正常，無囊泡化擴(kuò)張，胞質(zhì)內(nèi)可見大量微絲(圖1-A)。與對(duì)照組比較，高糖組細(xì)胞核形態(tài)不規(guī)則，核內(nèi)染色質(zhì)分布不均、顆?；?、凝集成塊并邊集，細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，線粒體有囊泡化擴(kuò)張，伴隨有自噬現(xiàn)象的產(chǎn)生，有明顯的細(xì)胞骨架微絲結(jié)構(gòu)改變(圖1-B)。與高糖組比較，空白血清各組細(xì)胞結(jié)構(gòu)無明顯差異(圖1-C、D、E)。與高糖組比較，干預(yù)各組神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)較高糖組有所改善，胞體形態(tài)結(jié)構(gòu)較完整，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器較多，可見較多的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體，染色質(zhì)均勻，并且高濃度組較低濃度組顯著(圖1-F、G、H)。

注：A為對(duì)照組；B為高糖組；C為空白血清低濃度組；D為空白血清中濃度組；E為空白血清高濃度組；F為綠茶低濃度組；G為綠茶中濃度組；H為綠茶高濃度組。

2.3 各組細(xì)胞損傷比較 高糖組LDH水平高于對(duì)照組(P<0.01)；綠茶低、中、高濃度組LDH水平均低于高糖組，且高濃度組低于低濃度組(P均<0.01)。綠茶各濃度組LDH水平均低于相應(yīng)空白血清對(duì)照組(P均<0.05)；不同濃度空白血清組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。LDH水平與綠茶血清濃度呈正相關(guān)(r2=0.856，P<0.05)。見表1。

2.4 各組細(xì)胞活性比較 高糖組CCK-8低于對(duì)照組(P<0.01)；各干預(yù)組CCK-8均高于高糖組，且高濃度組高于低濃度組(P均<0.05)。綠茶各濃度組CCK-8均高于相應(yīng)空白血清對(duì)照組(P均<0.05)。不同濃度空白血清組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。CCK-8與綠茶血清濃度呈正相關(guān)(r2=0.993，P<0.05)。見表1。

表1 各組LDH與CCK-8水平比較

3 討論

糖尿病腦病是以認(rèn)知功能障礙為特征的糖尿病嚴(yán)重慢性并發(fā)癥之一，其對(duì)中樞神經(jīng)的影響已經(jīng)引起重視，嚴(yán)重影響糖尿病患者的晚年生活[5]。目前對(duì)糖尿病腦病的發(fā)病機(jī)制存在很多解釋，包括神經(jīng)細(xì)胞的凋亡、胰島素分泌不足或抵抗、缺血缺氧、氧化應(yīng)激、突觸可塑性變化、非酶促糖基化終末產(chǎn)物的形成和大腦出現(xiàn)老化等[6]。但由于糖尿病腦病的病理生理機(jī)制尚不十分清楚，因而也缺乏明確的藥物干預(yù)方法。本研究模擬體內(nèi)的高血糖環(huán)境進(jìn)行海馬神經(jīng)細(xì)胞的體外培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，高糖組海馬神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)多樣化，胞體內(nèi)出現(xiàn)空泡，突起回縮，細(xì)胞器腫脹且數(shù)量減少，呈現(xiàn)出明顯的退變現(xiàn)象，表明升高糖濃度可引起神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變；而且LDH、CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，高糖組海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷程度升高、活性明顯下降，進(jìn)一步證實(shí)糖濃度的升高可引起海馬神經(jīng)細(xì)胞的損傷，這可能是糖尿病腦病的發(fā)病機(jī)制之一。

綠茶是我國的主要茶類之一，為不發(fā)酵茶，其特性決定了它能較多地保留茶葉的天然物質(zhì)，為發(fā)酵類茶等所不及，具有抗氧化、抗癌、抗糖尿病、抗衰老、降血脂等多種藥理作用。茶葉的神經(jīng)保護(hù)作用是近年來茶葉與健康領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。研究發(fā)現(xiàn)，茶葉中含有茶多酚、生物堿、茶氨酸等生物活性物質(zhì)，具有保護(hù)神經(jīng)功能特性作用，相較于化學(xué)藥物，茶葉的神經(jīng)保護(hù)作用具有多靶點(diǎn)、低毒副作用、協(xié)同功效等優(yōu)點(diǎn)[7]。研究表明，茶多酚、生物堿和茶氨酸都能夠滲透血腦屏障進(jìn)入腦組織，飲茶可降低AD、帕金森癥等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病率，降低認(rèn)知功能障礙。Qi等[8]研究茶多酚對(duì)持續(xù)黑暗和血紅素氧合酶(HO)誘導(dǎo)的小鼠腦SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)茶多酚能減弱HO引起的細(xì)胞活力損失和線粒體功能障礙，抑制SH-SY5Y細(xì)胞凋亡并使細(xì)胞內(nèi)ROS和HO的水平降低，因此茶多酚對(duì)氧化應(yīng)激引發(fā)的神經(jīng)細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。Zukhurova等[9]首先證明茶氨酸可以改善谷氨酸受體激動(dòng)劑誘導(dǎo)的腦缺血再灌注損傷，對(duì)誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，與高糖組相比，綠茶各濃度組海馬神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)規(guī)則飽滿，突觸增多，超微結(jié)構(gòu)改善，說明綠茶血清干預(yù)可降低糖濃度升高時(shí)的海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷；與高糖組比較，綠茶各濃度組海馬神經(jīng)細(xì)胞活性升高且損傷程度下降，且綠茶各濃度組LDH、CCK-8水平與綠茶血清濃度具有相關(guān)性，表明在一定范圍內(nèi)藥物作用具有濃度依賴性，隨綠茶浸出液濃度增高，細(xì)胞活性升高，損傷程度下降；反之活性降低，損傷程度增加。

目前國內(nèi)外研究主要集中在茶葉提取物或單一成分直接用于體外實(shí)驗(yàn)[10]，但綠茶成分復(fù)雜，藥理作用具有多靶點(diǎn)、多層次的特點(diǎn)，故以單一成分的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果來評(píng)價(jià)其在體內(nèi)的效應(yīng)不夠確切和客觀[11]，同時(shí)茶葉直接作用于體外實(shí)驗(yàn)無法評(píng)價(jià)其在體內(nèi)發(fā)揮生物效應(yīng)的真正有效成分[12]。中藥血清藥理學(xué)是給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物服用藥物，間隔一段時(shí)間后提取含藥血清再進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)研究的一種研究方法。這種實(shí)驗(yàn)方法不僅能從局部功能進(jìn)行觀察，而且可以排除中藥直接體外用藥的一系列干擾，更加接近藥物在體內(nèi)的真實(shí)過程，可體現(xiàn)藥物本身以及自身代謝產(chǎn)物所產(chǎn)生的藥理作用，有利于探討藥物在體內(nèi)直接發(fā)揮藥效的物質(zhì)及作用機(jī)制[13]。本實(shí)驗(yàn)按血清藥理學(xué)方法制備含藥血清，并通過相同劑量多次給藥后采血，根據(jù)藥代動(dòng)力學(xué)理論，相同劑量多次給藥并固定給藥時(shí)間的間隔，有利于血藥濃度達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，此時(shí)采集的含藥血清是進(jìn)行藥理實(shí)驗(yàn)研究的理想階段[14]。研究表明，多數(shù)藥物在達(dá)到峰濃度時(shí)間為給藥后1～2 h，采血時(shí)間一般定為給藥2 h后，也可在末次連續(xù)給藥2次，間隔1 h，第2次給藥1 h后采血。根據(jù)本課題組前期對(duì)綠茶進(jìn)行的藥代動(dòng)力學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)綠茶部分成分在大鼠血清中達(dá)到峰濃度時(shí)間為1.5 h左右[15]，故本實(shí)驗(yàn)在末次給藥1.5 h后取血。有文獻(xiàn)表明，含藥血清在采集后多經(jīng)過56 ℃ 30 min滅活處理，并認(rèn)為血清滅活這一常規(guī)處理方法是必要的，既可滅活掉血清中的部分補(bǔ)體，減弱對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的非藥物性影響，又符合減少微生物感染的常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)要求。故本實(shí)驗(yàn)血清經(jīng)過56 ℃ 30 min滅活處理，并且也設(shè)定了嚴(yán)格的空白血清對(duì)照組來排除血清的非藥物性干擾。本研究發(fā)現(xiàn)，與高糖組相比，綠茶血清各組細(xì)胞形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)和細(xì)胞活性均有改善，且細(xì)胞損傷程度下降，而空白血清各組細(xì)胞則無明顯改變，因此可排除空白血清對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生的影響，進(jìn)一步證明綠茶可降低糖濃度升高時(shí)海馬神經(jīng)細(xì)胞的損傷，具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用。

綜上所述，高糖可引起海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷，綠茶干預(yù)可降低糖濃度升高對(duì)海馬神經(jīng)細(xì)胞的影響，使細(xì)胞形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)均得到改善，且細(xì)胞活性升高，損傷程度下降，可能是綠茶發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用、進(jìn)而降低機(jī)體的認(rèn)知功能障礙的機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)為綠茶應(yīng)用于臨床延緩糖尿病腦病的發(fā)病以及防治神經(jīng)退行性疾病提供了依據(jù)。