劉紫君，韓宇博，彭鵬，婁宏君，劉莉

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，哈爾濱150040)

代謝綜合征(MS)是一系列能導(dǎo)致心腦血管疾病的代謝紊亂狀態(tài)，給患者和社會帶來的負(fù)擔(dān)日益嚴(yán)重，而IR及肥胖是引起和組成MS的關(guān)鍵[1]。脂肪組織是體內(nèi)主要能量儲備系統(tǒng)，是胰島素作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)，也是糖脂代謝發(fā)生的主要場所[2]，故常用脂肪細(xì)胞模型研究糖脂代謝。黃連溫膽湯是古代名方，符合MS辨證要點(diǎn)，本課題組前期研究證實其可明顯改善MS患者的多項代謝指標(biāo)，尤其對于IR的各項指標(biāo)均有很好的改善[3,4]。磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)是重要的胰島素受體后信號通路之一，從胰島素與受體結(jié)合到激活下游葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(GLUT4)向細(xì)胞膜移動完成葡萄糖攝取，中間經(jīng)過多層的級聯(lián)信號傳導(dǎo)，該條通路中的環(huán)節(jié)發(fā)生異常可引起信號傳導(dǎo)障礙，細(xì)胞利用葡萄糖能力下降，導(dǎo)致IR發(fā)生。2016年10月～2018年4月，我們以服用過黃連溫膽湯的大鼠含藥血清作用于小鼠脂肪細(xì)胞IR模型，觀察此含藥血清對脂肪細(xì)胞IR的改善情況，初步探討相關(guān)分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、動物、試劑與儀器 3T3-L1小鼠胚胎成纖維細(xì)胞株購買于中國科學(xué)院細(xì)胞庫。SPF級雄性SD大鼠30只，購買于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，體質(zhì)量(200±20)g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實驗研究。Ori Cell TMSD大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基試劑盒(賽業(yè)生物科技有限公司)；葡萄糖測定試劑盒(中生北控生物科技公司)；SYBR qPCR Mix(日本Toyobo，TYB-QPS-201)；兔Anti-IRS1抗體、兔Anti-phospho-IRS1(Tyr612)抗體、兔Anti-GLUT4抗體(博奧森)；兔Anti-PI3K p85α抗體(Abcam)；兔Anti-phospho-PI3K p85α(Tyr607)抗體(博歐特)；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(Biosharp)；鹽酸二甲雙胍購買于天津阿爾法生物科技有限公司。倒置相差顯微鏡(CKX41FS，日本奧林巴斯)；酶標(biāo)儀(MULTISKAN FC，Thermo)；Real time PCR儀(CFX96，Bio-Rad)。

1.2 含藥血清制備

1.2.1 黃連溫膽湯制備 黃連溫膽湯組方為黃連10 g、清半夏15 g、竹茹15 g、枳實15 g、陳皮15 g、茯苓20 g、生姜5 g、甘草10 g，所有飲片購買于黑龍江中醫(yī)藥附屬第一醫(yī)院草藥局。稱取黃連溫膽湯的所有中藥飲片，生藥量共105 g，加入14倍量的蒸餾水，煎煮3次。每次煮沸后再煎煮1 h，紗布過濾，3次藥液合并，減壓濃縮至稠膏狀，并用凍干機(jī)做成凍干粉。用蒸餾水稀釋凍干粉至生藥濃度為2.1 g/mL的藥液(按60 kg人與200 g大鼠體表面積等效劑量折算，終濃度相當(dāng)于成人給藥量的24倍)。

1.2.2 動物干預(yù)及血清制備 取15只SD大鼠，每日灌服黃連溫膽湯凍干粉稀釋液2次，早8時和晚20時各灌胃1次，灌胃后給予適量鼠糧，以模擬臨床中湯劑早飯前、晚飯后的分服。另15只SD大鼠每日灌服等體積蒸餾水。均連續(xù)給藥5 d。最后一次灌藥1 h后，戊巴比妥那腹腔注射，麻醉狀態(tài)下，仰臥位固定，沿腹正中線逐層打開腹腔，腹主動脈采血，3 000 r/min，離心15 min，分離上層血清，得到黃連溫膽湯含藥血清及空白血清，于-80 ℃存放。

1.3 脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化 采用經(jīng)典雞尾酒方法。取5%CO2、37 ℃培養(yǎng)條件下的3T3-L1細(xì)胞，待融合度達(dá)到100%將培養(yǎng)基換成3 mL誘導(dǎo)培養(yǎng)基A液；3 d后換成2 mL誘導(dǎo)培養(yǎng)基B液；24 h后換回A液；A液和B液更替再重復(fù)兩次；用B液維持培養(yǎng)4～7 d。將細(xì)胞用10%甲醛固定，加入油紅O染液，異丙醇清洗后顯微鏡下觀察，95%以上呈成熟脂肪細(xì)胞表型，細(xì)胞內(nèi)有明顯脂滴，為脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)成功[5]。

1.4 IR脂肪細(xì)胞模型制備 在分化成熟的脂肪細(xì)胞中，加入含有1 μmol/L地塞米松的增殖培養(yǎng)基，培養(yǎng)96 h后以葡萄糖消耗量明顯降低，即構(gòu)建為IR脂肪細(xì)胞模型，且36 h內(nèi)模型穩(wěn)定[6]。

1.5 黃連溫膽湯最佳干預(yù)濃度及時間確定 取IR脂肪細(xì)胞，分為四個水平，每個水平設(shè)3個復(fù)孔，均培養(yǎng)于DMEM高糖+5%FBS培養(yǎng)基，分別給予高劑量中藥(8%含藥血清)、中劑量中藥(4%含藥血清+4%空白血清)、低劑量中藥(2%含藥血清+6%空白血清)、無中藥(8%空白血清)，分別培養(yǎng)12、24和36 h。收集培養(yǎng)板各孔培養(yǎng)液，應(yīng)用葡萄糖氧化酶法葡萄糖測定試劑盒測定培養(yǎng)液中葡萄糖的含量，計算葡萄糖消耗量。以葡萄糖消耗量明顯升高為依據(jù)，最終確定4%含藥血清為最佳干預(yù)濃度、36 h為最佳干預(yù)時間。

1.6 細(xì)胞分組及干預(yù)方法 取IR脂肪細(xì)胞，隨機(jī)分為模型組、黃連溫膽湯組和二甲雙胍組。另取未進(jìn)行IR造模的脂肪細(xì)胞作為正常組。每組各設(shè)3個復(fù)孔。各組細(xì)胞均培養(yǎng)于DMEM高糖+5%FBS培養(yǎng)基，模型組、黃連溫膽湯組和二甲雙胍組分別加入8%空白血清、4%含藥血清+4%空白血清、鹽酸二甲雙胍溶液1 mmol/L，正常組加入8%空白血清。培養(yǎng)36 h。

1.7 PI3K-GLUT4信號通路相關(guān)基因檢測 采用TRIzol法提取RNA，Real time qPCR法檢測PI3K-GLUT4信號通路相關(guān)基因胰島素受體底物1(IRS1)、PI3K-p85α亞基、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(GLUT4)mRNA表達(dá)。設(shè)正常組的mRNA表達(dá)量為1，測得各組的閾循環(huán)值(Ct值)，計算2-ΔΔCt，分析各基因相對mRNA表達(dá)變化。

1.8 PI3K-GLUT4信號通路相關(guān)蛋白檢測 采用Western blotting法，檢測IRS1、p-IRS1(Tyr612)、PI3K-p85α、p-PI3K-p85α(Tyr607)、GLUT4蛋白表達(dá)。X線膠片蛋白條帶的灰度值結(jié)果使用凝膠圖像處理系統(tǒng)進(jìn)行掃描，磷酸化蛋白的灰度值與其對應(yīng)蛋白的灰度值之比作為磷酸化蛋白的相對表達(dá)量，其余各組蛋白的灰度值與內(nèi)參GAPDH的灰度值之比作為相應(yīng)蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組脂肪細(xì)胞葡萄糖消耗量 正常組、模型組、黃連溫膽湯組、二甲雙胍組葡萄糖消耗量分別為(18.863±0.117)、(13.073±0.587)、(16.613±0.947)、(15.867±0.127)mmol/L，模型組葡萄糖消耗量低于正常組，黃連溫膽湯組葡萄糖消耗量高于模型組(P均<0.05)。

2.2 各組PI3K-GLUT4信號通路相關(guān)基因表達(dá)比較 與正常組比較，模型組GLUT4 mRNA表達(dá)下調(diào)，黃連溫膽湯組和二甲雙胍組GLUT4 mRNA表達(dá)上調(diào)(P均<0.05)；與模型組比較，黃連溫膽湯組和二甲雙胍組GLUT4 mRNA表達(dá)上調(diào)(P均<0.01)；與二甲雙胍組比較，黃連溫膽湯組GLUT4 mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。各組間IRS1、PI3K-p85α mRNA表達(dá)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1 各組PI3K-GLUT4信號通路相關(guān)基因表達(dá)比較[M(P25,P75)]

2.3 各組PI3K-GLUT4信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)結(jié)果 與正常組比較，模型組p-IRS1(Tyr612)/IRS1、p-PI3K-p85α(Tyr607)/PI3K-p85α和GLUT4蛋白表達(dá)下調(diào)(P均<0.05)；與模型組比較，黃連溫膽湯組和二甲雙胍組上述三種蛋白表達(dá)水平均上調(diào)(P均<0.05)；與二甲雙胍組比較，黃連溫膽湯組上述三種蛋白表達(dá)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表2、圖1～3。

表2 各組PI3K-GLUT4信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較

圖1 各組p-IRS1 (Tyr612)蛋白表達(dá)情況Western blotting法)

圖2 各組p-PI3K-p85α(Tyr607)蛋白表達(dá)情況(Western blotting法)

圖3 各組GLUT4蛋白表達(dá)情況(Western blotting法)

3 討論

IR和肥胖是引起和組成MS的關(guān)鍵因素，控制IR和肥胖的發(fā)生進(jìn)展是改善MS狀態(tài)的重要途徑。IR作為MS的主要發(fā)病機(jī)制，貫穿于MS全過程[7]。脂肪組織是體內(nèi)最大、最重要的能量儲備系統(tǒng)，是胰島素作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)，也是糖脂代謝發(fā)生的主要場所。因此，如果脂肪細(xì)胞發(fā)生對胰島素的不敏感甚至抵抗，必然會大幅影響糖脂代謝，其結(jié)果就是導(dǎo)致葡萄糖攝取利用減少，葡萄糖堆積剩余[2]。IR與肥胖又互相影響，眾多研究表明，胰島素敏感與否是影響肥胖的重要因素[8]。3T3-L1脂肪細(xì)胞由3T3-L1小鼠胚胎成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)分化而來，當(dāng)細(xì)胞從快速分裂到長滿且接觸抑制時，該細(xì)胞系會從前脂肪細(xì)胞向脂肪樣細(xì)胞逆轉(zhuǎn)，是常用于建立成熟脂肪細(xì)胞模型的細(xì)胞系之一。本研究使用3T3-L1脂肪細(xì)胞IR模型進(jìn)行研究，更能代表體內(nèi)胰島素調(diào)節(jié)糖脂代謝的進(jìn)程，模擬MS關(guān)鍵因素的糖脂代謝狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組葡萄糖消耗量低于正常組，說明胰島素抵抗模型建立成功。

胰島素與受體結(jié)合后將激活胰島素受體后信號通路，PI3K/Akt是其中重要的一條通路。經(jīng)過多層的級聯(lián)信號傳導(dǎo)，激活下游GLUT4向細(xì)胞膜移動完成葡萄糖攝取。如果信號通路受到影響，會導(dǎo)致細(xì)胞利用葡萄糖能力下降，進(jìn)而產(chǎn)生IR，最終導(dǎo)致MS的發(fā)生。IRS是PI3K/Akt信號通路上游的重要部分，IRS1是其最主要的異構(gòu)體[9]，而p-IRS1(Tyr612)則是IRS1的612位點(diǎn)酪氨酸磷酸化的形式，可以理解為是它的活性形式，通過這種活性形式可以將胰島素的信號繼續(xù)傳導(dǎo)進(jìn)入下游通路，所以p-IRS1(Tyr612)占IRS1的比例反映了有效參與傳導(dǎo)胰島素信號的通路蛋白的多少。PI3K由調(diào)節(jié)亞基p85和催化亞基p110組成[10]，調(diào)節(jié)亞基p85的表達(dá)直接參與糖脂代謝[11]，p-PI3K-p85α(Tyr607)是其607位點(diǎn)酪氨酸磷酸化的形式，p-PI3K-p85α(Tyr607)占PI3K-p85α的比例也反映了傳導(dǎo)胰島素信號的效率。本研究發(fā)現(xiàn)，IRS1和PI3K-p85α mRNA水平的表達(dá)在黃連溫膽湯含藥血清處理后并未有明顯改變，說明含藥血清調(diào)節(jié)IR可能不是從轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行的。然而，IRS1的Tyr612位點(diǎn)磷酸化蛋白相對IRS1總蛋白表達(dá)水平存在差異，與正常組比較，模型組p-IRS1(Tyr612)/IRS1蛋白表達(dá)量下調(diào)，表明IR-3T3-L1脂肪細(xì)胞IRS1的酪氨酸磷酸化減少；黃連溫膽湯組此比值較模型組增多，表明黃連溫膽湯可促進(jìn)IRS1磷酸化，提高胰島素信號傳導(dǎo)的效率。此外，PI3K-p85α的酪氨酸607(Tyr607)位點(diǎn)磷酸化蛋白相對PI3K-p85α總蛋白表達(dá)水平也存在差異，模型組p-PI3K-p85α(Tyr607)/PI3K-p85α下調(diào)，表明IR脂肪細(xì)胞PI3K-p85α的酪氨酸磷酸化減少，引起胰島素信號傳導(dǎo)障礙。經(jīng)黃連溫膽湯或二甲雙胍干預(yù)，此比值較模型組上調(diào)，表明PI3K是黃連溫膽湯改善IR的靶點(diǎn)之一。

同時我們也檢測了此信號通路下游的GLUT4的表達(dá)情況，與正常組比較，模型組脂肪細(xì)胞GLUT4 mRNA表達(dá)下調(diào)，同時模型組GLUT4蛋白的表達(dá)量也較正常組下降，應(yīng)用黃連溫膽湯或二甲雙胍干預(yù)后，GLUT4 mRNA及蛋白的表達(dá)量被上調(diào)，表明黃連溫膽湯可上調(diào)GLUT4基因表達(dá)水平，增強(qiáng)PI3K和GLUT4之間的胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，改善脂肪細(xì)胞IR程度。

黃連溫膽湯是古代名方，出自清代陸廷珍所著《六因條辨》，諸藥合用共奏清熱燥濕、健脾化痰和胃之功，主治膽胃不和，痰熱內(nèi)擾證之心煩、失眠、胸悶、頭身困重、嘔惡口苦、苔黃膩、脈滑數(shù)等。符合MS辨證要點(diǎn)，用之臨證治療MS，可改善各代謝組分療效顯著且毒副作用小，能發(fā)揮中醫(yī)藥多途徑、多靶點(diǎn)的整體調(diào)節(jié)優(yōu)勢。前期基礎(chǔ)研究表明，黃連溫膽湯可降低飲食誘導(dǎo)MS大鼠血壓、血糖、體質(zhì)量、血脂水平，綜合改善MS各代謝組分[3,12～14]。

在中藥復(fù)方的體外藥理作用研究中，直接用藥物進(jìn)行實驗難以確定發(fā)揮藥效的主要成分，因中藥復(fù)方成分眾多，但只有通過首關(guān)消除后，吸收入血的成分才能繼續(xù)發(fā)揮藥效，成為藥效物質(zhì)的基礎(chǔ)(不通過首關(guān)消除的藥物除外)，因此口服中藥血清中含有的原型成分、代謝產(chǎn)物、與機(jī)體作用形成的新成分，才可能是真正的有效成分。而且離體反應(yīng)系統(tǒng)無法替代真實的體內(nèi)環(huán)境，經(jīng)過復(fù)雜的體內(nèi)吸收代謝過程，一些原藥成分可能會發(fā)生理化變化[15]。故本實驗采用含藥血清方法來代表藥物體內(nèi)過程，以進(jìn)一步進(jìn)行認(rèn)定、分離體內(nèi)移性成分，從體內(nèi)直接作用化學(xué)成分的角度確定黃連溫膽湯改善IR的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，黃連溫膽湯組葡萄糖消耗量高于模型組，提示含藥血清確能顯著增加脂肪細(xì)胞的葡萄糖消耗量，表明黃連溫膽湯血清對IR有明顯的改善作用；經(jīng)黃連溫膽湯含藥血清干預(yù)后， PI3K、IRS和GLUT4的蛋白活性部分均較模型組增高，且GLUT4 mRNA表達(dá)水平也較模型組上調(diào)，說明黃連溫膽湯改善IR是通過PI3K-GLUT4信號通路進(jìn)行的。

綜上所述，黃連溫膽湯含藥血清可有效改善鼠脂肪細(xì)胞的IR，其機(jī)制可能是通過PI3K-GLUT4信號通路實現(xiàn)的。