馬 娜 李佳佳 周 靜 董 翔 路 軍 唐 軍李建瑛 是文輝 許 琴 張東輝 宋來陽 劉江偉

(新疆軍區(qū)總醫(yī)院新疆特殊環(huán)境醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830000)

中暑是熱應(yīng)激的嚴(yán)重形式，是一種威脅生命的嚴(yán)重疾病，臨床上定義為核心體溫超過40 ℃，機(jī)體溫度調(diào)節(jié)失敗，中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常出現(xiàn)抽搐、昏迷、譫妄等癥狀[1]，而熱射病是中暑的嚴(yán)重類型。高熱可引起全身炎癥反應(yīng)導(dǎo)致多器官功能障礙或衰竭，包括在大腦、肺、心臟、胃腸道、腎的出血和壞死[2]。我們前期研究表明，沙漠干熱環(huán)境中暑可引起大鼠心肌損害[3-4]。姜黃素(curcumin，CUR)是姜黃中提取的一種植物多酚化合物[5]，可通過減輕氧化應(yīng)激、炎癥、細(xì)胞凋亡和纖維化來防止心肌損傷，姜黃素長期以來一直是世界范圍內(nèi)的一種調(diào)味品和一種傳統(tǒng)藥物。有研究發(fā)現(xiàn),姜黃素通過發(fā)揮抗氧化及抗凋亡作用提高心肌功能，降低心臟功能損害[6]。姜黃素是否能對(duì)熱射病大鼠的心肌損傷具有保護(hù)作用，目前國內(nèi)外尚未見文獻(xiàn)報(bào)道，本研究采用姜黃素預(yù)處理，通過觀察中暑大鼠心肌病理學(xué)、超微結(jié)構(gòu)變化及心肌酶CK、CK-MB、LDH水平的變化，探討了姜黃素對(duì)心肌損傷的保護(hù)作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)環(huán)境

SPF級(jí)雄性SD大鼠50只，購自新疆維吾爾自治區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，生產(chǎn)合格證號(hào)[SCXK(新)2011-0001]，體質(zhì)量220～260 g。動(dòng)物飼養(yǎng)在[溫度：(21±1)℃，相對(duì)濕度：(45±5)%]SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，自由攝取食水，使用許可證編號(hào)[SYXK(新)2016-0003]。實(shí)驗(yàn)方案獲新疆軍區(qū)總醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)取材等相關(guān)工作在新疆軍區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科屏障動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施進(jìn)行[SCXK(新)2011-0003]。并按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 儀器與試劑

西北地區(qū)特殊環(huán)境人工實(shí)驗(yàn)艙(新疆軍區(qū)總醫(yī)院研制)，電子稱(上海儀器廠)，分析天平(上海儀器廠)，全自動(dòng)生化儀，電子顯微鏡，BI2000圖像分析系統(tǒng)。姜黃素購自日本化成株式會(huì)社，羧甲基纖維素鈉購自上海源葉生物科技有限公司。

1.3 方法

將SD大鼠放置在SPF室內(nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，溫度(25±2)℃，相對(duì)濕度40%～50%，每12 h明暗交替。隨機(jī)將大鼠分為5組：①常溫對(duì)照組(Normal control)，生理鹽水灌胃；②干熱對(duì)照組(Dry-heat control)，生理鹽水灌胃；③低劑量姜黃素預(yù)處理組(L-cur)，50 mg/kg姜黃素+5%羧甲基纖維素鈉溶液配置成混懸液灌胃；④中劑量姜黃素預(yù)處理組(M-cur)， 100 mg/kg姜黃素+5%羧甲基纖維素鈉溶液配置成混懸液灌胃；⑤高劑量姜黃素預(yù)處理組(H-cur)，200 mg/kg姜黃素+5%羧甲基纖維素鈉溶液配置成混懸液灌胃；各個(gè)實(shí)驗(yàn)組連續(xù)灌胃7 d，大鼠自由攝食飲水(均經(jīng)滅菌處理)。在實(shí)驗(yàn)的第8天，除常溫對(duì)照組外，其余4組大鼠轉(zhuǎn)移至由新疆軍區(qū)總醫(yī)院自行研制的人工氣候艙(西北特殊環(huán)境人工實(shí)驗(yàn)艙)內(nèi)，環(huán)境溫度(41±0.5) ℃，相對(duì)濕度(10±1)%，禁食禁水。復(fù)制以前建立的熱射病大鼠模型[4]，在實(shí)驗(yàn)開始后150 min，大鼠以3%戊巴比妥腹腔麻醉后處死，取下腔靜脈血液保存并離心15 min，-80 ℃保存，全自動(dòng)生化檢測(cè)儀檢測(cè)血清CK、CK-MB、LDH水平。HE染色：取下腔靜脈血液后，切取適當(dāng)大小心臟組織，5%生理鹽水沖洗后放入新鮮配制的4%甲醛中固定，進(jìn)行石蠟包埋和切片，HE染色后觀察心臟病理變化；電鏡：切取心臟心尖部大小約1.5 mm x1.5 mm x1.5 mm 大小心臟組織，立即放入新鮮配制的2.5%的戊二醛中，將固定后的心肌組織送新疆醫(yī)科大學(xué)，用高倍透射電子顯微鏡觀察心肌結(jié)構(gòu)，拍照并進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對(duì)中暑大鼠血清心肌酶的影響

大鼠血清心肌酶CK、CK-MB、LDH結(jié)果顯示，NC組、姜黃素預(yù)處理各濃度組與DHC組之間有顯著性差異(P<0.01)；姜黃素預(yù)處理各濃度組之間有顯著性差異(P<0.01)，呈梯度遞減。見圖1。

圖1 姜黃素對(duì)中暑大鼠血清CK、CK-MB、LDH的影響注：a：與DHC組比較， P<0.01；b：與L-cur組比較P<0.01；c：與M-cur組比較P<0.01Fig.1 Effect of curcumin on serum CK, ck-mband LDH in rats with heat strokeNote: a: compared with DHC group, P<0.01;B: compared with thel-cur group, P<0.01;C: compared with the m-cur group, P<0.01

2.2 HE染色光鏡觀察

NC組心肌肌束排列整齊，DHC組光鏡下部分心肌組織細(xì)胞壞死斷裂，并可見中性粒細(xì)胞浸潤；L-cur組可見心肌細(xì)胞間少量的中性粒細(xì)胞并有輕微的血管擴(kuò)張；M-cur組心肌組織細(xì)胞水腫較嚴(yán)重，部分細(xì)胞核腫脹或濃縮或消失；H-cur組心肌細(xì)胞間有少量的嗜酸變。姜黃素預(yù)處理組隨著姜黃素濃度的增加，其損傷逐漸減輕，見圖2。

圖2 姜黃素預(yù)處理對(duì)熱射病大鼠心肌組織病理改變(HE×40)注：A：常溫對(duì)照組(NC)；B：干熱對(duì)照組(DHC)；C：姜黃素50 mg/kg(L-cur)；D：姜黃素100 mg/kg(M-cur)；E：姜黃素200 mg/kg(H-cur)Fig.2 The pathological changes of myocardial tissue in rats with the pretreatment of curcumin (HE×40)Note: A: normal temperature control group (NC);B: dry heat control group (DHC);C: curcumin 50 mg/kg(L-cur);D: curcumin 100 mg/kg(M-cur);E: curcumin 200 mg/kg(H-cur)

2.3 電鏡觀察心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

NC組心肌細(xì)胞形態(tài)完整，肌纖維排列整齊，線粒體排列整齊，Z線清晰；DHC組心肌細(xì)胞線粒體腫脹，線粒脊結(jié)構(gòu)紊亂，部分肌絲斷裂，部分線粒體排列不規(guī)則；H-cur組心肌細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)較完整，線粒體有增生的現(xiàn)象，胞核膜清晰，核仁數(shù)量較多，Z線較為清晰，排列較為規(guī)則，見圖3。

3 討論

熱射病是一個(gè)威脅生命的疾病,其特征是40 ℃以上的核心體溫升高,導(dǎo)致多器官衰竭,如循環(huán)沖擊和肝功能衰竭以及心臟衰竭[7]。它是引起全身炎癥、血管內(nèi)凝血和組織病變的一種全身炎癥反應(yīng)綜合征。由于高熱引起熱耗散導(dǎo)致體表血管擴(kuò)張，使流入內(nèi)臟器官的血液減少，如治療不及時(shí)，可使多臟器衰竭導(dǎo)致生命體征完全消失[8]。

本研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素預(yù)處理對(duì)于干熱環(huán)境下不同程度中暑的大鼠模型心肌損傷均具有預(yù)防作用，心肌酶CK、CK-MB和LDH存在于心肌和骨骼肌等組織細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和線粒體中，它們?cè)谛呐K病變或受損時(shí)表現(xiàn)出不同程度的升高，干熱對(duì)照組血清中CK、CK-MB、LDH 的活力異常升高，表明了環(huán)境高溫導(dǎo)致心肌損傷。本次研究中姜黃素高劑量組心肌酶CK、CK-MB、LDH與其他組對(duì)比有明顯差異，隨著姜黃素劑量升高，高心肌酶的水平明顯降低。另外，HE染色光鏡觀察及電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，DHC組大鼠在熱應(yīng)激情況下組織細(xì)胞病變嚴(yán)重，姜黃素干預(yù)組明顯好轉(zhuǎn)，說明姜黃素有很好的保護(hù)作用。

心臟是機(jī)體循環(huán)系統(tǒng)的始動(dòng)器官，在熱應(yīng)激機(jī)體自我調(diào)節(jié)下起非常重要的作用。心血管研究的一個(gè)重要方面是新藥物的開發(fā)和現(xiàn)有藥物對(duì)缺血心肌保護(hù)、心肌血管生成的促進(jìn)以及心肌梗死后心臟重塑和功能改善的研究[9]。姜黃素是一種廣泛使用的藥物，已成為心血管研究領(lǐng)域的研究對(duì)象。 Lu等[10]研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死與壞死、凋亡有關(guān)，并引起組織和器官功能紊亂。姜黃素對(duì)缺血和缺氧心肌有保護(hù)作用,增加bcl-2和PPAR-γ表達(dá),抑制細(xì)胞凋亡和NF-κB表達(dá),減少炎癥。目前認(rèn)為姜黃素可以通過減輕氧化應(yīng)激、炎癥、細(xì)胞凋亡和纖維化來防止心肌損傷。 Xiao等在體內(nèi)和體外進(jìn)行了一系列的實(shí)驗(yàn)研究，以評(píng)估膠原沉積、CF增殖和遷移、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)誘導(dǎo)的ECM降解和SIRT1表達(dá)。研究結(jié)果顯示，對(duì)心肌纖維化有一定的保護(hù)作用，這部分是由SIRT1激活引起的[11]。 Zhou等研究結(jié)果表明姜黃素有助于降低細(xì)胞凋亡和自噬水平，通過上調(diào)Bcl-2表達(dá)量，下調(diào)Bax和beclin-1的表達(dá)水平提高細(xì)胞活力。此外，姜黃素抑制H9c2細(xì)胞中BNIP3和SIRT1的表達(dá)，通過降低細(xì)胞凋亡和自噬水平，證明了姜黃素對(duì)心肌H/R損傷的保護(hù)作用[12]。 Liu等發(fā)現(xiàn)并證明姜黃素的抗氧化和抗凋亡作用，可以改善由于心肌梗死導(dǎo)致的心肌功能衰弱和心臟的損害。姜黃素誘導(dǎo)磷酸化，在JAK2和STAT3中，上調(diào)心肌Bcl-2/Bax表達(dá)使caspase-3失活。姜黃素對(duì)于誘導(dǎo)的再灌注損傷的心臟具有保護(hù)作用，使其用于限制心肌梗死和細(xì)胞凋亡[13]。

本研究首次將姜黃素應(yīng)用于沙漠干熱環(huán)境熱射病大鼠的心肌保護(hù)研究之中，研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素對(duì)沙漠干熱環(huán)境下中暑大鼠心肌具有保護(hù)作用且呈現(xiàn)劑量依賴性，以高濃度效果最好。姜黃素作為傳統(tǒng)藥物，具有高效、副作用小等特點(diǎn)，在沙漠干熱環(huán)境下預(yù)防心肌損傷具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。