魏影 郭妍 柏柳 陳艷麗 黃嶸赫 余治健 鄧啟文 李桂秋

腸球菌是人和動物腸道內重要的正常菌群，近年腸球茵屬細菌引發(fā)的感染不斷增加，糞腸球菌已成為醫(yī)院內感染的重要病原菌之一[1-4]。生物膜形成是細菌耐藥的重要原因之一，生物膜形成也是糞腸球菌的重要特點，以往我們的研究表明其陽性率超過50%，即使是一些非耐藥的腸球菌也能形成難以根除的生物膜。近年紅霉素耐藥糞腸球菌已經(jīng)成為較高的比例，紅霉素耐藥糞腸球菌在我國主要有erm基因介導耐藥傳播，多種G+細菌已經(jīng)報道紅霉素耐藥株具有克隆聚集性和不同的耐藥特點，然而紅霉素耐藥糞腸球菌的分子特點和生物膜形成特點仍無報道。多個毒性因素與糞腸球菌生物膜的形成有關，糞腸腸球菌的毒力因子有聚類物質、表面蛋白、細胞溶解素、明膠酶E、透明質酸酶、信息素誘導蛋白、膠原結合蛋白、心內膜炎抗原及信息素等[5-8]。紅霉素耐藥糞腸球菌中這些毒力因子的分布尚不清楚。因此，本實驗主要探討紅霉素耐藥糞腸球菌生物膜形成特點與毒力基因和耐藥基因特點之間的關系，分析該類細菌生物膜形成特點。

1 材料和方法

1.1 材料

收集251株自深圳市南山醫(yī)院2010年1月—2017年6月分離自患者標本的糞腸球菌，質控菌株是糞腸球菌菌株ATCC29212和OG1RF （ATCC47077）。

1.2 方法

1.2.1 菌株鑒定和藥敏試驗 采用BD Phoenix-100全自動細菌鑒定/藥敏系統(tǒng)進行藥敏試驗，主要藥物包括阿米卡星（丁胺卡那霉素）、氨芐西林、苯唑西林、復方磺胺、紅霉素、環(huán)丙沙星、甲氧芐胺嘧啶、利福平、利奈唑胺、青霉素、慶大霉素、四環(huán)素、替考拉寧、頭孢西丁、萬古霉素、呋喃妥因。采用2017年版美國臨床和實驗標準化協(xié)會（CLSI）推薦的微量肉湯稀釋法再次確認紅霉素耐藥標準，以糞腸球菌ATCC29212作為質控菌株。紅霉素敏感、中介和耐藥的MIC值定義為MIC≤0.5 mg/L、MIC 1～4 mg/L 和 MIC ≥ 8 mg/L。

1.2.2 毒力基因的檢測 毒力基因引物由北京六合華大基因公司合成[9-10]。按試劑盒說明提取菌株基因組DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩２捎肞CR檢測毒力基因。PCR體系（50 μl）：Dream Taq Green PCR Master Mix（2×） 25 μl，上、下游引物各 1 μl，DNA 2 μl，加dd H2O補至50 μl。PCR反應條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸 1 min，共30個循環(huán)；72 ℃ 10 min，PCR產物于4 ℃保存。PCR反應產物均用1%的瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)有無陽性擴增產物及目的基因片段長度進行判斷分析。

1.2.3 生物膜檢測及判讀 根據(jù)參考方法，對生物膜的形成進行了檢測[4]。對在TSB培養(yǎng)基中過夜生長的細菌；稀釋200與TSBG培養(yǎng)基中，其中有0.5%的葡萄糖；每孔200ul加樣到96孔聚苯乙烯微板上，每個菌株3個復孔；37攝氏度的情況下靜態(tài)孵化24小時；吸干孔子菌液并用PBS清洗3次，用甲醇固定15分鐘后吸干，用0.5%的結晶紫染色10分鐘后吸干，再用蒸餾水沖洗；最后加入4：1無水乙醇和丙酮的匯合溶液，混合均勻后在OD570光度下檢測。每一項試驗至少進行三次。生物膜OD值的判讀在染色后的96個微孔讀數(shù)從0.05到3.5不等。生物膜表型分類基于他人的方法，強陽性（OD570＞2），中等（OD570，1～2），或弱（OD570＞0.5和OD570＜1）。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 18.0軟件完成。計量資料兩組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 紅霉素耐藥糞腸球菌生物膜的形成特點

在結晶紫染色后的96孔板讀數(shù)從0.04到3.5。生物膜表型分類基于他人的方法分為（OD570＞2），中等（OD570，1～2），或弱（OD570＞0.5和＜1）[4-5]。OG1RF控制菌株（弱生物膜）和ATCC29212菌株OD570的中值分別為0.95和0.22。在所有被檢測的糞腸球菌分離菌株中，有超過一半的糞腸生物膜表現(xiàn)為弱陽性及以上，在這些生物膜形成的菌株中，弱生物膜表型、中等生物膜表型和強生物膜表型中菌株數(shù)相差不大。利用肉湯稀釋法測定了紅霉素的MIC值，并對MIC 8 μg/mL的抗性標準進行了分類，發(fā)現(xiàn)192株含有紅霉素抗性的菌株；紅霉素敏感、中介和耐藥的糞腸球菌生物膜形成的流行率為71.4%（5/7）、51.9%（27/52）和58.9%（113/192）（見表1）。值得注意的是強生物膜形成比例在紅霉素耐藥和中介菌株中高于紅霉素敏感組（19.8% vs.13.5%vs.0），中介組和耐藥組強生物膜形成比例差異無統(tǒng)計學意義。

2.2 紅霉素耐藥糞腸球菌生物膜形成與紅霉素耐藥基因之間的聯(lián)系

PCR檢測結果提示紅霉素耐藥糞腸球菌的耐藥基因ermA、ermB和ermC陽性檢出率分別為1/192、155/192和1/192；ermA和ermC各自檢測到一株陽性株，生物膜分別為強陽性和陽性，但陽性基因菌株數(shù)量太少，ermA和ermC耐藥基因與生物膜形成之間關系仍有待進一步研究。ermB基因與生物膜形成相關性經(jīng)統(tǒng)計學分析無顯著相關性（P＞0.05）（見表2）。

2.3 生物膜形成與毒力基因間的相關性

表3所示，192株糞腸球菌紅霉素耐藥的菌株，對PCR擴增毒性基因的分析表明，esp、asal 和cylA陽性糞腸球菌分離菌株比其相對應的陰性分離株的生物膜形成率顯著提高。此外，生物膜的形成與esp和cylA毒力基因有關。

3 討論

本研究結果提示糞腸球菌生物膜形成陽性率為57.8%，低于歐洲先前報道的60%～90%的流行率[5-8]。特別是在這項研究中，從膽汁中分離出來的糞腸球菌生物膜的流行率為36.4%，比由尿液和血液分離出來的生物膜陽性率低了超過20.0%，我們的生物膜陽性率與其他地區(qū)報道的不一致可能與地區(qū)差異有關。本研究結果提示紅霉素耐藥糞腸球菌的陽性率（58.9%）與紅霉素中介組差異無統(tǒng)計學意義，但高于紅霉素敏感組，可能與紅霉素敏感菌株入組例數(shù)太少有關，紅霉素敏感組的糞腸球菌生物膜形成比例有待進一步研究?？傮w而言，紅霉素耐藥糞腸球菌生物膜陽性在糞腸球菌中并沒有顯著偏高，但強陽性的菌株在紅霉素耐藥組和中介組比例高于敏感組需要引起注意。

糞腸球菌生物膜形成和抗生素耐藥關系的研究報道較多。近年報道提示利奈唑胺耐藥株生物膜形成比例顯著升高，耐藥株中強生物膜形成菌株顯著高于利奈唑胺敏感菌株組。紅霉素耐藥基因的檢測中發(fā)現(xiàn)，糞腸球菌主要攜帶ermB基因，ermA、 ermB和ermC基因與生物膜的形成沒有相關性。

本研究發(fā)現(xiàn)紅霉素耐藥糞腸球菌中esp+分離株更有可能表現(xiàn)出強或中等的生物膜形成，這與之前的幾項研究一致，這些研究表明該毒力基因和糞腸球菌生物膜形成之間聯(lián)系[9-10]。本研究提示hyl基因和gelE基因與糞腸球強或中生物膜形成成反比；這與先前的研究結果，能夠水解明膠、膠原蛋白和血紅蛋白的gelE可能有利于糞腸球菌生物膜的發(fā)展不一樣；但也有另一些研究則發(fā)現(xiàn)，在糞腸球菌中，gelE的存在與生物膜的形成沒有顯著的相關性。此為本實驗中還發(fā)現(xiàn)了cylA與糞腸球菌生物膜的形成成正比；此前有報道稱，CylA與尿道分離的糞腸球菌生物膜形成有關。因此紅霉素耐藥糞腸球菌中CylA基因和Esp基因與生物膜形成密切相關[11-13]。

表1 紅霉素敏感性與生物膜形成之間的關系分析

表2 紅霉素耐藥糞腸球菌生物膜形成與耐藥基因之間的關系

表3 紅霉素耐藥糞腸球菌生物膜形成與毒力基因之間關系

總之，目前的研究表明紅霉素耐藥糞腸球菌容易形成生物膜，耐藥組生物膜形成陽性率與紅霉素中介組比較差異無統(tǒng)計學意義。紅霉素耐藥糞腸球菌生物膜形成能力與ermB基因無顯著相關性。esp、gelE和cylA與紅霉素耐藥糞腸球菌生物膜形成顯著性相關。